人工培养蛹虫草核苷类HPLC指纹图谱建立.docVIP

人工培养蛹虫草核苷类HPLC指纹图谱的建立 　　建立了蛹虫草（Cordyceps militaris）核苷类高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的分析方法，采集10批不同产地人工培养蛹虫草HPLC图谱，运用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件建立人工蛹虫草标准图谱并以该模式为参照，计算10批不同产地蛹虫草之间的相似度。结果表明：方法的稳定性、精密度、重现性符合方法学要求；建立的核苷类HPLC指纹图谱共得到10个共有峰，并对确认了虫草素和腺苷峰这两个特征峰，各样品图谱与标准指纹图谱的相似度均在0.9以上。 　　人工蛹虫草； 高效液相色谱（HPLC）； 指纹图谱； 核苷 　　蛹虫草（Cordyceps militaris），又名蛹草菌、北虫草、北冬虫夏草，与冬虫夏草同属于麦角菌科、虫草属，是一种具有很高药用价值的真菌。研究表明，人工蛹虫草主要药用成分与冬虫夏草相近，是冬虫夏草的优良替代品[1]。核苷类物质为其主要有效成分之一，尤其是腺苷具有明显的药理作用，《中国药典》也主要以腺苷含量作为冬虫夏草的质量控制指标[2]。近年来，蛹虫草的人工栽培技术已成熟，并进入了产业化生产阶段，然而目前市场上人工培育的蛹虫草质量参差不齐，无统一的质量控制标准。因此，建立蛹虫草质量标准以控制其品质具有重要意义。 　　指纹图谱技术能全面反映中药内在化学成分的种类及数量，目前国际上已普遍认可中药指纹图谱作为中药质量控制的标准 [3]。HPLC方法具有灵敏、分离度高、精确、快速的优点，在中药的成分分析中显示出巨大的优势，与传统的质量控制方法相比，HPLC指纹图谱更注重特征谱图的整体性，可明确的揭示样品中各化学成分的分布及含量。因此，笔者参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》[4] 的要求，收集10批不同产地的人工培养蛹虫草，应用HPLC指纹图谱技术，建立了人工培养蛹虫草核苷类HPLC标准指纹图谱，为蛹虫草的质量监控提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　十批不同产地人工蛹虫草来源见表1。 　　1.2主要仪器与试剂 　　Agilent1200高效液相色谱仪配备二极管阵列检测器（美国安捷伦公司）；Agilent ZOBAX Eclipse XDBC18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）不锈钢柱；AS10200ADT超声波清洗器；虫草素和腺苷标准品购自中国药品生物制品检定所；甲醇（色谱纯）购自美国Fisher公司。 　　1.3标准品和样品溶液的制备 　　精密称取虫草素、腺苷标准品各10 mg于50 mL容量瓶中，用20%甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，备用。 　　蛹虫草样品粉碎后过60目筛，精密称取样品粉末0.5 g，加入20%甲醇20 mL，30 ℃、40 kHz超声提取1 h，冷却后用20%甲醇定容至50 mL，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜过滤，配成样品溶液，备用。 　　1.4色谱条件 　　色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流速1.0 mL/min；检测波长260 nm，进样体积20 μL；柱温30 ℃。流动相A：甲醇，流动相B：超纯水。梯度洗脱程序：0 min（0%A）→5 min（5%A）→15 min（20%A）→25 min（35%A）→30 min（35%A）。 　　1.5方法学考察 　　稳定性试验：取5号样品溶液于0、4、8、12、24 h测定，考察方法的稳定性。 　　精密度试验：取5号样品溶液，连续进样5次，记录色谱图，考察方法的精密度。 　　重现性试验：取5号样品，1.3中的方法平行制备供试溶液5份，记录5份样品的色谱图，考察方法的重现性。 　　1.6HPLC指纹图谱的构建 　　按照1.3的方法制备10批不同来源蛹虫草供试液，记录其HPLC色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件，将10批蛹虫草样品色谱图以AIA格式导入，以5号为参照图谱，设定时间窗宽度为0.1 min，进行谱峰自动匹配。以平均数法作为标准图谱的生成方法。 　　1.7特征峰定性 　　取腺苷和虫草素标准品溶液上HPLC分析。通过保留时间的比对，确定样品色谱图中腺苷和虫草素这两个特征峰。 　　1.8指纹图谱评价 　　以指纹图谱中峰面积最大的峰为参照峰，以参照峰的保留时间和峰面积作为1，分别计算10批样品共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件计算指纹图谱的相似度。 　　2结果与分析 　　2.1人工培养蛹虫草样品HPLC色谱图分析 　　按1.3和1.4方法制备及测定样品，样品色谱图（图1）基线平稳，峰形良好，分离度好。对蛹虫草进行120 min的图谱监测，从色谱峰达到基线分离开始计算，共检测到10个