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细菌内毒素定量检查法 天津大学易泰实验室 革兰氏阴性菌细胞壁结构 细菌内毒素结构 内毒素致病机理 内毒素的特性 很强的耐热性，250℃1小时以上的干烤才能灭活，只要工艺中的高压灭菌不能完全取出。 很容易吸附在容器上和聚集在一起，必须严格按照标准操作规范操作才能检测到准确的数值。 发展现状 1.我国2000版药典细菌内毒素检查法共收载药品69中，美国700多种，同先进国家相比差距很大。 2.目前国外在实际检测中70%以上运用的是定量法。 3.我国2000版药典细菌内毒素检查法应用指导原则正式列入，定量法在我国得到肯定、应用和推广。 细菌内毒素常用测定方法 凝胶法(Gel-Clot technique)： 限度试验、半定量试验 比色法(Chromogenic Assay)： 终点比色法、动态比色法 比浊法(Turbidimetric Assay)： 终点比浊法、动态浊度法 凝胶法 在100×75mm的小试管内，加入待检样品于鲎试剂混合，37℃60分钟后，180°倒转，根据凝胶形成的有无作为判定指标的一种半定量方法。此方法不需要专用仪器。 比色法 根据北内毒素激活的凝固酶水节鲎三肽中精氨酸肽链，释放出对硝基苯胺（PNA)，用冰醋酸终止反应进行吸光度测定，或用游离的PNA和偶氮试剂反应，最终形成偶氮蓝复合物显色而进行比色测定的一种方法。 比浊法 根据内毒素与鲎试剂的反应机理，被激活的凝固酶切断凝固蛋白原中特定位置的精氨酸肽链，形成凝固蛋白，产生浊度变化，用适当浊度仪进行定量分析的一种方法。 内毒素与鲎试剂的凝胶反应 不同浓度的内毒素反应曲线 鲎试剂定量检测内毒素原理 检测样品原理 内毒素定量法日趋成熟 内毒素工作标准品已经比较稳定 定量法鲎试剂已经能够满足要求 标准操作规范能够确保试验重现性 即开即用型实验器材确保试验无污染 已经建立了多种药品的定量法 已经有了一大批定量检测的人才 细菌内毒素定量实验方法 1.标准曲线的可靠性实验: r-0.98 2.供试品的干扰实验: MVD=L.C/λ1 3.测定及判断: 回收率50%-200% 4.供试品的定量测定：测定结果与L比较 动态浊度法原理-标准曲线 内毒素含量浓度与反应时间 浓度与反应时间分别取对数后 将两组数据用最小二乘法统计 能够拟合出直线：标准曲线 十倍稀释标准曲线 例：把内毒素标准品稀释为10 EU/ml ，1 EU/ml ，0.1 EU/ml ，0.01EU/ml四个浓度 优点：检测范围宽，线性好，易操作。 缺点：相对于对倍稀释的标准曲线数据准确性稍差。 对倍稀释标准曲线 例：把内毒素标准品稀释为0.5 EU/ml ，0.25EU/ml ，0.125 EU/ml ，0.0625EU/ml，0.03125 EU/ml 五个浓度。 优点：数据准确性好。 缺点：曲线范围窄，线性稍差，初学者不易于操作。 标准曲线制作有效性评价 最少有四个连续浓度梯度点。 相关系数 r-0.98。 标准品回收率应在100±25%。 每个点至少2个平行管，平行管的变异系数不应大于10%。 连作3条标准曲线的合并后，仍满足以上条件可以存档供日常检测。 检品实验 检品内毒素限值的确定：L=K/M 最大有效稀释倍数的确定：MVD=LC/λ1 干扰实验（预实验）： R=(Es - Et)/ λm ×100% 实验结果的判断：回收率50-200% 回收管的制备 方法：互溶法。用稀释倍数相当于0.5倍所需倍数的检品溶液加上等体积的2倍所需浓度的标准内毒素。 举例：制备含0.25 EU/ml内毒素 的80倍检品稀释液，用1ml40倍检品稀释液加上1ml含 1EU/ml 的标准品内毒素溶液，得到含0.5 EU/ml 内毒素的80倍检品稀释液。 定量法的关键—回收率 1.药典规定:回收率50-200% 2.可以根据回收率的大小判定检品中干扰因素的种类(增强或抑制)和程度。 3.定量法可以排除对鲎实验为增强类型的干扰因素，而凝胶法则不能。 定量测定的优越性 直观‘看’到鲎试验的反应过程 通过反应曲线，直观显示鲎试剂的反应过程 可以通过反应曲线，考察样品中的干扰 快速、准确测到样品中的内毒素含量 有利于针剂药品的生产过程质量控制 可以测到病人体液中的内毒素含量作为疾病诊断依据 动态浊度法定量测定的优点 记录鲎试验反应的全过程 精确获知内毒素含量 操作简单 可靠性高 快速的质量控制 诊断某些疾病的辅助手段 动态浊度法与凝胶法比较（1） 结果判别方法 动态浊度法：直接测出样品内毒素含量，与规定的限值比较，不超标即为合格。 凝胶法：用相应灵敏度的鲎试剂反应，不发生凝胶即为阴性合格。 反应速度 动态浊度法：使用OD限值法一般