安徽乌菜DNA提取与InDel引物筛选.docVIP

安徽乌菜DNA提取与InDel引物筛选 　　摘 要： 利用改良的SDS法提取了153个品种的安徽乌菜DNA，并进行2次重复，均获得了较理想的DNA产物。通过试验确定了安徽乌菜InDel-PCR的10 μL最佳反应体系：1× PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL ， 引物1 μL，Taq E 0.1 μL，DNA 1 μL， ddH2O 6.7 μL； 最佳PCR扩增反应程序：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，55 ℃ 退火40 s，72 ℃ 延伸40 s，共36个循环，最后72 ℃ 延伸10 min，10 ℃ 保存。从供试的66对InDel引物中筛选出31对适合安徽乌菜、条带清晰、重复性高、多态性好的引物，为安徽乌菜品种鉴定、遗传多样性分析等奠定了基础。 　　关键词： 安徽乌菜； DNA提取； InDel； 引物筛选 　　Abstract： In this research，we extracted DNA 153 varieties of Wucai grown in Anhui with two replication by modified SDS method. We obtained good quality DAN. 10 μL optimum InDel-PCR reaction system was determined by the experiments： 1×PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL，1 μL primer，Taq E0.1 μL，DNA 1 μL，6.7 μL ddH2O and the best PCR amplification reaction procedure： 94 ℃ pre degeneration in 5 min； 30 s 94 ℃ degeneration，annealing at 55 ℃ 40 s，72 ℃ for 40 s，a total of 36 cycles. The last 72 ℃ was 10 min，and the reaction solution preserved at 10 ℃. From 66 pairs of primers，we selected 31pairs of primers with clear band，high repeatability，and high polymorphism. These InDel markers are useful for Anhui Wucai variety identification and genetic diversity study. 　　Key words： Anhui Wucai； DNA extraction； InDel； Primer screening 　　乌菜（Brassica campestris L. ssp. Chinese（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee）别名乌塌菜、塌棵菜、黑菜等，2n=20，是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种 [1]。安徽乌菜原产于江淮之间的北部，是安徽省的著名特产之一[1]，在安徽省的栽培历史悠久，栽培区域也越来越广。目前对乌菜的研究主要致力于高产栽培技术的总结[2]、主要农艺性状及相关分析[3]、植物学性状[4]等方面，而缺乏分子生物学方面的深入研究。 　　InDel（insertion-deletion）标记是指在等位基因位点上一定数量的核苷酸插入或缺失一段相对短的核苷酸序列而产生的长度多态性变异[5]。它作为分子标记的一种，可以较容易地通过生物信息学的方法获得，InDel标记检测方法具有简单、经济实用、特异性高、稳定性好[6]、分布广[7]等特点，已在亲缘关系鉴定[8]、多态性分析[9]、纯度鉴定[10]、图位克隆[11]等领域被广泛应用。本试验目的是筛选出适合安徽乌菜InDel-PCR反应的引物，为安徽乌菜遗传多样性分析及核心种质构建提供前提条件，对乌菜的种质资源鉴定、重要性状基因定位与乌菜种质创新及新品种选育均具有重要的意义。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　试验时间为2012年9月至2013年5月。供试材料为在安徽省合肥、六安、蚌埠等市收集的安徽乌菜品种及经自交、杂交所得的乌菜材料。本试验所用引物均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 DNA提取 播种后40 d，取幼嫩的叶片提取DNA，2次重复，DNA提取采用改良的SDS法[12]。 　　1.2.2 引物筛选 选取表现型差异较大的6个不同乌菜材料，利用InDel分子标记进行PCR扩增，筛选出适