扁玉螺ISSR-PCR反应体系的建立及其优化.docVIP

扁玉螺ISSR-PCR反应体系的建立及其优化 　　摘要：以扁玉螺基因组DNA为材料，分析了Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物以及模板DNA浓度对ISSR-PCR扩增效果的影响，建立了一套适合扁玉螺的ISSR-PCR反应体系。该反应体系包括：2.0 mmol?L-1的Mg2+，0.25 mmol?L-1的dNTP，0.8 U的Taq DNA聚合酶，0.2 μmol?L-1的ISSR引物和40 ng模板DNA。利用优化后的反应体系，从30条ISSR引物中筛选出13条扩增效果较好的引物，为进一步利用ISSR标记研究扁玉螺的遗传多样性奠定了基础。 　　关键词：扁玉螺；ISSR-PCR；引物筛选 　　中图分类号：Q75；S961.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114(2008)05-0575-03 　　 　　Establishment and Optimization of the ISSR-PCR Reaction System for Neverita didyma 　　SUN Shi-wei1，SUN Zhen-xing1，CHEN Yan-ni1，WU Ke2 　　(1. Life Science College，Ludong University，Yantai 264025，Shandong，China； 　　2. The Eighth Elementary School，Economic-technological Development Area Yantai 264006，Shandong，China) 　　Abstract：The influence of Mg2+，dNTP，Taq DNA polymerase，ISSR primer and template DNA concentration on the result of ISSR-PCR amplification was analyzed using the genomic DNA of Neverita didyma. The ISSR-PCR reaction system was established for Neverita didyma. The reaction system was as follows：2.0 mmol?L-1 Mg2+，0.25 mmol?L-1 dNTP，0.8 U Taq DNA polymerase，0.2 μmol?L-1 ISSR primer，40 ng template DNA. Using the optimized reaction system，13 primers with good polymorphism screened from 30 ISSR primers were used to conduct ISSR analysis. The result provided basis for further the analysis of genetic diversity of Neverita didyma by ISSR marker. 　　Key words：Neverita didyma；ISSR-PCR；primer screening 　　 　　扁玉螺(Neverita didyma Roding)属软体动物门、腹足纲、前鳃亚纲、中腹足目、玉螺科，是一种分布于我国黄渤海以及朝鲜半岛、日本和东南亚沿海的贝类[1]，其个体较大，肉味鲜美，具有一定的食用和经济价值。目前人们对扁玉螺的利用主要是采捕野生资源，但由于其自然资源量正在逐步减少，扁玉螺已成为潜在的人工养殖开发对象。因此，研究扁玉螺种质资源的遗传多样性，搞清其群体遗传结构和遗传变异，对于充分开发利用及保护扁玉螺资源都具有重要的意义。 ISSR(inter simple sequence repeat)，简单重复序列区间的简称，是近年来在微卫星技术上发展起来的一种新型分子标记技术[2]。ISSR为显性标记，具有孟德尔遗传特征，因此被广泛地应用于各种生物的遗传多样性分析、品种和种质鉴定以及物种和种群亲缘关系等方面研究[3-5]。有关扁玉螺分子遗传标记的研究国内外尚未见报道。本实验通过建立并优化扁玉螺的ISSR-PCR反应体系，可为今后开展扁玉螺的分子遗传学研究提供标准化程序。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料 　　扁玉螺采自山东烟台近海，活体运回实验室后解剖取足肌，放入-74℃超低温冰箱中保存备用。 　　1.2 ISSR引物和试剂 　　实验所用的30条ISSR引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR扩增和电泳所用的主要试剂，均购自北京鼎国生物