大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA及marA基因分析.doc

PAGE PAGE 7 大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析 张海旺1 邓旭明2* 张煜1 苏杰1 胡仲明3 （1.河北北方学院，河北 张家口，075131； 2.中国人民解放军军需大学，吉林 长春；130062；3.军事兽医研究所，吉林 长春；130062） 摘要：目的 检测大肠杆菌在某些抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系。方法 分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养，测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化；对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测序。结果 四环素诱导株产生多重耐药，氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药；四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致。结论四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突变，诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致。 关键词：大肠杆菌 多重耐药 外输泵 acrA marA 由于抗菌药物的广泛、持续和不当使用，各种病原菌对抗菌药物的耐药性日趋严重。现已发现细菌细胞膜上的外输泵（efflux pump）的表达水平提高，能主动将扩散入细菌细胞内的药物或其他底物泵出菌体外，从而使细菌获得非特异性的耐药性。大肠杆菌是畜禽的重要致病菌，是发现外输泵最多的细菌，现已发现了约30种外输泵。一般认为AcrAB－TolC是大肠杆菌主要的外输泵[1]。它包括药物质子转运子AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[2]。MarA是一个正调控蛋白，可增强acrAB和tolC的表达。本实验用四环素、氯霉素和环丙沙星通过人工体外诱导大肠杆菌使之产生耐药性，对AcrA和MarA的基因acrA和marA进行测序分析，检测耐药性产生与acrA和marA突变的关系。 1 材料和方法 1.1 材料 菌株：大肠杆菌质控株ATCC25922，购自吉林省卫生监督检测中心。 抗菌药：头孢噻肟、青霉素钾等，均为标准品或对照品，中国药品生物制品检定所出品；盐酸环丙沙星，对照品，中国兽医药品监察所出品。 染色试剂：结晶紫酒精饱和溶液、草酸铵溶液、革兰氏碘溶液、石碳酸复红溶液等按《药品微生物学检验手册》[3]进行配制。 载体与质粒：克隆载体为pGEM－T，Promega公司产品。 酶与试剂：T4 DNA连接酶、Ex TaqTM DNA 聚合酶、各种限制性内切酶、溶菌酶、蛋白酶K均为TaKaRa公司产品。 其他试剂：乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2）、焦碳酸二乙酯（DEPC），Sigma公司产品；dNTP、5－溴－4－氯－3－吲哚半乳糖苷（X－gal）、异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp）、琼脂糖、羟基甲基氨基甲烷（Tris）等均为TaKaRa公司产品；饱和酚、氯仿、异丙醇、CaCl2、葡萄糖、甲基红等，均为国产分析纯试剂； DNA片段凝胶回收试剂盒（Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0），TaKaRa公司产品； 国家自然基金资助项目，No作者介绍：张海旺，生于1956年，博士，教授。研究方向：耐药机理。*通讯作者 E-mail：zhw5148@ 分子量标准参照物：DNA Marker DL2,000、λ－Hind Ⅲ digest DNA Marker，均为TaKaRa公司产品。 引物：根据GenBank中acrA、marA基因序列设计PCR扩增引物：acrA的上游引物（PACR－F）序列为5′－ATG AAC AAA AAC AGA GGG TTT ACG CCT－3′；下游引物（PACR－R）5′－TTA AGA CTT GGA CTG TTC AGG CTG－3′，marA的上游引物（PMAR－F）序列为5′－ATG ACG ATG TCC AGA CGC AAT AC－3′，下游引物（PMAR－R）5′－CTA GCT GTT GTA ATG ATT TAA TGG－3′。上海博亚生物技术有限公司合成。 仪器：生物显微镜，OLYMPUS产品；PCR扩增仪，TC－25/H型，杭州 DAHE THERMO－MAGNETICS CO.LTD产品；电泳仪，DYY－6B型，北京市六一仪器厂产品；空气浴振荡器，HZQ－C，哈尔滨市东明医疗仪器厂生产；高速台式冷冻离心机，TGL－16M，长沙湘仪离心机仪器有限公司生产等。 1.2. 方法 1.2.1 菌株鉴定 对购进的菌株作生化和形态鉴定，以确保菌株的可靠性：用营养肉汤作复苏培养，再将菌液接种于琼脂平板37oC培养至长出菌落；取上一步得到的单菌落进行糖发酵试验（