《基因工程》第二节工具酶.ppt

（八）连接酶 （十）碱性磷酸酶 本章结束! 第二章:基因工程工具酶 主讲教师: 杨应斌 答疑QQ号: 715656164 基因工程 一、DNA限制性内切酶 二、甲基化酶 　三、分子克隆过程中所需要的另一些酶 Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）发现了噬菌体λ的限制作用 各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。这些酶切割DNA的双链，因为它们的功能就是切割DNA，限制外源性DNA存在于自身细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。 合成限制酶的细胞自身的DNA可以不受这种酶的作用，因为细胞还合成了一种修饰酶，它改变了限制酶识别的DNA顺序的结构，使限制酶不能起作用。 目前，从各种生物中分离出的限制性内切酶已接近200种，其中80多种是切割DNA双链。 （一）命名原则 限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。现在通用的命名原则是： 属名 种名 株名 如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表。 Haemophilus influeuzae d 酶名 Hind III Escherichia coli RY13 EcoRⅠ （二）分类和特性 第二类限制性内切酶的识别顺序是一个回文顺序, 如EcoRI的识别顺序为： 5’……G*A-A-T-T- C……3’ 3’……C- T- T-A-A*G……5’ 讨论:下面的序列中可能含有多少个潜在的酶切位点? GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGA 1 3 2 6 5 4 一、DNA限制性内切酶 二、甲基化酶 　三、分子克隆过程中所需要的另一些酶 二、甲基化酶 限制-修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶（methylase）来完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序。甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。 DNA 甲基化酶普遍存在于原核和真核生物中，能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或者是胞嘧啶上。 在原核生物中，DNA 甲基化酶作为限制修饰系统的一个组成部分广泛存在，它们的作用是保护宿主菌不被相应的限制性内切酶切割。大多数实验室使用的大肠杆菌包括三种位点特异性的 DNA 甲基化酶。 由 dam 基因（Dam 甲基化酶）编码的甲基化酶能将甲基转移到 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位点上。 由 dcm 基因编码的 Dcm 甲基化酶，能在CCAGG 和 CCTGG 序列内部的胞嘧啶C5 位置上甲基化。 EcoKI 甲基化酶，可将 AAC（N6A）GTGC 和 GCAC（N6A）GTT 上的腺嘌呤进行甲基化修饰。 (1) 原核生物ＤＮＡ甲基化 如果限制性内切酶的识别位点是从表达 Dam或 Dcm 甲基化酶的菌株中分离而得，并且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠，那么该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能不被切割。 例如，从 dam+ E.coli 中分离的质粒 DNA 完全不能被识别序列为 GATC 的 MboI 所切割。 E.coli 菌株中的 DNA 甲基化程度并不完全相同。pBR322 DNA 能被完全修饰（因此完全不能被 MboI 切割），而 λDNA 只有大约 50% 的 Dam 位点被甲基化，这是因为在 λDNA 被包装到噬菌体头部之前，甲基化酶还没来得及将 DNA 完全甲基化。因此，被 Dam 或 Dcm 甲基化完全阻断的酶却能对这些 λDNA 进行部分切割。 被 Dam 或 Dcm 甲基化的限制性位点可以通过克隆 DNA 至 dam- /dcm- 菌株【如 dam- /dcm- E.coli 感受态细胞（NEB #C2925）】进行去甲基化。 (1) 真核生物ＤＮＡ甲基化 在高等真核生物（如 Dnmt1）中发现的 CpG 甲基转移酶（CpG MTases），将甲基基团转移至胞嘧啶残基上的 C5 位点。 CpG 甲基化形式受遗传因素的影响，具有组织特异性，并与基因表达相关。因此，我们推测 CpG 甲基化在基因分化和表达中起了一定的作用。 在消化真核基因组 DNA 时尤其要关注 CpG甲基化的影响。需要注意的是，一旦 DNA 被克隆到宿主菌中，将不存在 CpG 甲基化形式。 一、DNA限制性内切酶 二、甲基化酶 　三、分子克隆过程中所需要的另一些酶 （一）DNA聚合酶 （二）RNA聚合酶 （三）反转录酶 （四）核酸外切酶 （五）核酸酶S1 （六）DNA酶 （七）RNA酶 （八）连接酶 （九）末端转移酶 （十）碱性磷酸酶 （一）DNA聚合酶 （DNa polymerase）的作用是将1个脱氧三磷酸核苷酸加到引物（primer）的3’-OH上，释放出一个焦磷酸分子（ppi) 聚合酶主要有以下两种种： 1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 2．