利用PCR―DGGE技术研究稻草与黑麦草混合青贮过程中菌群动态变化.docVIP

利用PCR―DGGE技术研究稻草与黑麦草混合青贮过程中菌群动态变化 　　摘要：为了探讨稻草与黑麦草混合青贮发酵过程中微生物的动态变化规律，以稻草、黑麦草为青贮原料，从青贮后1、5、12、21、31、61、99、154 d的稻草、黑麦草混合青贮样中取样，分别测定pH值，采用培养方法计数乳酸菌、酵母菌、霉菌数量的变化，使用PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术分析青贮过程中菌群组成多样性。结果表明：黑麦草与稻草混合青贮pH值在青贮初期下降迅速，乳酸菌数量在5d达到最高峰，然后逐渐下降，酵母菌数量呈先降后升再降等波动变化，稻草与黑麦草混合青贮过程中优势菌主要有植物乳杆菌（Lactoacillus plantarum）、类肠膜魏斯氏菌（Weissella paramesenteroides）、食窦魏斯氏菌（W. cibaria）、短乳杆菌（L.brevis），且随着青贮时间延长，优势菌数量下降。由结果可知，将DGGE和16S rRNA序列分析技术结合，能有效地研究青贮细菌的遗传多样性和组成的变化。 　　关键词：青贮；微生物培养；动态变化；PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE） 　　中图分类号： S182文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）11-0123-04[HS）][HT9.SS] 　　秸秆的饲料化利用，是其资源化利用的有效途径之一，也是促进农区草食动物发展的重要措施。我国农作物秸秆总量达52 056万t以上，其中稻草21 129万t[1]。稻草与其他禾本科牧草青贮原料相比，干物质含量高，但茎叶上自然附着的乳酸菌数量少，可溶性碳水化合物含量低[2]，所以常规青贮很难调制出高品质的青贮料。多花黑麦草具有可溶性碳水化合物含量高、纤维素和木质素含量低的优点，但其含水量高，直接青贮容易产生大量的渗出液，导致青贮饲料酸度大，从而降低青贮饲料的营养成分[3]。水稻秸秆和黑麦草混合青贮，不仅能解决稻草可溶性碳水化合物含量低、青贮不易成功的问题，还能解决黑麦草水分含量高、不易青贮的问题。李君临等指出，黑麦草单独青贮不易成功，与水稻秸秆按7 ∶[KG-*3]3混合青贮时发酵品质最佳，显著降低了氨态氮占总氮的比例以及乙酸、丙酸和丁酸的含量[4]。青贮饲料是个复杂的微生物共生体系，主要包括乳酸菌、酵母菌、霉菌及其他腐败细菌[5]，而青贮饲料品质的优劣直接取决于乳酸菌的增殖与变化。在发酵初期，乳酸菌开始增殖，随着pH值的逐渐下降和厌氧程度的加强，乳酸菌在数量上逐渐形成绝对优势，其他微生物的生长受到抑制，乳酸菌产生大量乳酸，使pH值进一步下降，其他微生物的活性进一步减弱，当pH值下降到一定程度以后，乳杆菌的活性也受到了抑制[6]。可见，青贮过程中微生物数量及种群的动态变化研究十分重要。包慧芳等指出，玉米秸秆青贮饲料发酵过程中优势菌主要有植物乳杆菌（Lactoacillus plantarum）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），且采用菌剂处理后青贮玉米pH值下降更快，其优势细菌种类更丰富[7]。詹发强等研究发现，乳杆菌属、片球菌属是青贮玉米发酵的启动菌之一，在发酵前期一直存在，但在发酵后期，乳杆菌属是玉米青贮过程中乳酸菌的主要菌群[8]。杨云贵等指出，在玉米青贮过程中，主要微生物随着青贮时间的延长呈现逐步减少的趋势，而乳酸菌在青贮第6、7天数量最高，之后呈现缓慢下降的趋势[9]。目前，有关黑麦草与稻草混合青贮发酵过程中微生物动态变化规律没有相关报道。 　　本研究通过跟踪微生物数量在稻草与黑麦草混合青贮过程中的变化情况，以及利用PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）方法对稻草与黑麦草混合青贮中细菌多样性进行研究，从而了解青贮发酵过程中微生物动态变化规律，以期为青贮微生物研究及复合型添加剂的研制提供科学依据。 　　1材料与方法 　　1.1青贮的制作与采样 　　将新鲜的多花黑麦草、水稻秸秆切短至2～3 cm，按多花黑麦草 ∶[KG-*3]水稻秸秆质量比=7 ∶[KG-*3]3进行混贮，用聚酯乙烯（52 cm×38 cm）青贮，每袋装至半袋（约500 g），没有加入添加剂，用真空封口机封口。分别于青贮后1、5、12、21、31、61、99、154 d开袋取样。 　　1.2青贮pH值测定 　　称取25 g样品，加入200 mL三角瓶中，加入700 mL蒸馏水后置于4 ℃冰箱内浸提24 h。然后通过2层纱布和滤纸过滤，测定滤液pH值。 　　1.3菌株分离培养方法 　　称取样品10 g放入已灭菌的小三角瓶中，加入90 mL无菌生理盐水，密封，在摇床上以120 r/min摇2 h。用1层无菌纱布过滤青贮草渣，然后逐级稀释