半夏泻心汤及其拆方对胃电节律失常大鼠胃组织缝隙连接蛋白Cx43表达影响.docVIP

半夏泻心汤及其拆方对胃电节律失常大鼠胃组织缝隙连接蛋白Cx43表达影响 　　摘要：目的 探讨半夏泻心汤调节胃运动的配伍规律。方法 选取90只健康SD雄性大鼠，分为正常组10只和模型组80只。复制大鼠胃电节律失常模型，经胃电生理学指标评价后，根据半夏泻心汤的配伍特点，将其拆分为辛开、苦降、甘补、辛开苦降、辛开甘补、苦降甘补组，每组10只。各给药组按相同药物浓度不等体积连续灌胃4周。给药后进行胃电参数分析，采用免疫组化法、RT-PCR检测胃组织Cx43及其mRNA表达。结果 与正常组比较，模型组Cx43及其mRNA表达升高；与模型组比较，各给药组胃电慢波频率变异系数降低，各给药组Cx43及其mRNA表达降低，其中辛开甘补组作用最为显著。结论 半夏泻心汤调节胃运动机制可能与其降低缝隙连接蛋白Cx43及其mRNA表达有关，从而改变紊乱的胃电节律，达到改善胃运动功能的作用。 　　关键词：半夏泻心汤；Cx43蛋白；缝隙连接；胃运动；大鼠 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0075-05 　　胃肠道运动功能紊乱是大多胃肠道疾病的重要临床表现和发病机制，其发病率高。半夏泻心汤出自《伤寒论》，具有降逆止呕、消痞散结的作用。前期研究表明，半夏泻心汤对胃电节律失常大鼠胃壁SCF基因表达水平、胃肌间神经丛c-kit阳性间质细胞（ICC）含量表达均有影响[1]。胃肠神经-ICC-平滑肌细胞（SMC）网络结构和功能的变化对胃肠道动力障碍性疾病有重要的病理生理学意义。在胃肠道中，缝隙连接（GJ）是介导SMC和ICC细胞间电化学信息交流，保证肌肉活动的协调性和同步性的特殊通道。Cx43是构成GJ最重要的连接蛋白，广泛存在于胃肠Cajal与SMC之间。Cx43基因发生突变、数量减少，会影响细胞膜上GJ通道的数量，从而妨碍细胞间信号的传递，导致胃肠道运动功能障碍。本研究以Cx43为切入点，根据半夏泻心汤辛开苦降甘补的配伍特点，按照药味特点与中医病机结合分组的原则，采用析因实验设计研究半夏泻心汤及其拆方对ICC细胞Cx43的影响，进一步揭示半夏泻心汤调节胃运动的分子机制，阐释经方配伍规律。 　　1 实验材料 　　1.1 动物 　　健康4周龄SD雄性大鼠90只，体质量（180±20）g，北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号0309256。所有动物均给予大鼠全价营养颗粒饲料，饲养于北京中医药大学东直门医院屏障动物实验室。 　　1.2 药物 　　半夏泻心汤方的药物剂量比例按文献[2]换算。法半夏55.7 g，黄芩、干姜、人参、炙甘草各46.875 g，黄连15.62 g，大枣42 g。根据“法依病机，拆方依法”的研究思路[3]，将半夏泻心汤拆分为辛开组（法半夏、干姜）、苦降组（黄芩、黄连）、甘补组（人参、炙甘草、大枣）、辛开苦降组（法半夏、干姜、黄芩、黄连）、辛开甘补组（法半夏、干姜，人参、炙甘草、大枣）及苦降甘补组（黄芩、黄连、人参、炙甘草、大枣）。所有药物均为免煎颗粒，北京康仁堂药业有限公司。 　　1.3 主要试剂与仪器 　　4%多聚甲醛，solarbio公司；免疫组化通用试剂盒（鼠/兔）、DAB显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司；一抗Connexin43 Antibody（鼠抗人，单克隆抗体）、二抗goat anti- mouse IgM-HRP，Santa cruz公司；Trizol，Invitrogen公司；氯仿，索莱宝公司；异丙醇，北京益奥明科技有限公司；反转录试剂盒，Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix，ABI公司；所有引物均由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。多导生理仪EGG100C（BioPac公司，美国），SPOT software V3.0Ⅱ图像拍摄系统（Diagnostic instruments，美国），LD5-2A离心机（北京京立离心机有限公司），超声匀浆机（Pharmacia Biotech），紫外分光光度仪（Pharmacia，美国），实时荧光定量PCR仪MX3000P（Stratagene，美国）。 　　2 实验方法 　　2.1 分组、造模与给药 　　将大鼠随机分为正常组和模型组。正常组10只，常规饲养。模型组80只，不规则喂养4周，即大鼠每逢单日正常进食、双日禁食，以打乱其正常的饮食节律。自由饮水，水中加入盐酸（每升水加10 mol/L盐酸10 mL），以破坏胃内酸碱环境，制备大鼠胃电节律失常模型[4]。大鼠不规则喂养4周后，参考文献[4]进行胃电生理学评价，分析胃电慢波节律。模型大鼠胃电节律异常，胃动过速、胃动过缓和节律紊乱，与正常组比较有显著差异，提示造模成功。将标记好的80只模型大鼠随机分为模型组