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吉林地区华支睾吸虫虫卵鉴定及PCR检测方法建立 　　摘要：对华支睾吸虫病流行地区人粪样进行华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）虫卵的鉴定、收集及DNA的提取，然后根据华支睾吸虫基因设计两对特异性引物，以粪便中提取的虫卵DNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCR）方法扩增目的基因片段，对PCR方法的各种反应条件进行优化。结果两对引物中以上游引物（5′-TGGCCTGACTGGCTGGCCGG-3′）、下游引物（5′-CGGCACCCCACACACATACA-3′）为最适引物，用PCR方法可扩增到分子量大小为255 bp的特异性条带，测序结果经BLAST工具进行分析，与中国沈阳分离株（AF217099）和朝鲜分离株（AF217094）的同源性为100%；50 μL PCR反应体系的最优化反应条件为：dNTP 2.6 μL；10×PCR Buffer（含Mg2+）4.0 μL；上下游引物各0.5 μL；DNA模板5.5 μL；Taq DNA聚合酶0.4 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。试验成功对吉林地区人粪样中华支睾吸虫虫卵进行了鉴定，并建立了华支睾吸虫虫卵PCR检测方法，为从分子生物学角度检测华支睾吸虫病提供了理论依据。 　　关键词：华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）；虫卵DNA；鉴定；PCR 　　中图分类号：R446.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）07-1601-03 　　华支睾吸虫病是广泛流行于东亚地区和中国大部分省市的食源性寄生虫病，由寄生于人体肝胆管内的华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）引起，可产生严重的肝胆并发症，与胆管癌的关系也非常密切[1-6]。目前，对华支睾吸虫的研究主要集中在对其成虫或囊蚴的研究，而对虫卵的研究甚少，仅限于对虫卵的形态学研究。本试验采用聚合酶链式反应（PCR）对人粪便中的虫卵进行鉴别，从而鉴定人是否患有华支睾吸虫病，为PCR技术在华支睾吸虫病诊断中的应用奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　粪样来自吉林省白城市镇赉县流行区村民。 　　主要试剂及仪器：2% Triton X-100，KOH，蔗糖/KCl溶液，PCR扩增试剂，T载体，lower DNA Marker，琼脂糖，DNA凝胶回收试剂盒。Gene Amp PCR systerm 9700（AB公司），AR1140电子天平（USA），PY-120水平脱色摇床（北京鼎国生物技术发展中心），OLYMPUS CX31RTSF生物显微镜，NANODROP2000（Thermo公司），水浴锅，超净工作台，磁力搅拌器，振荡器，组织匀浆机。 　　1.2 方法 　　1.2.1 粪便的收集与筛选 每一粪样先进行初步筛选，将少量生理盐水加入粪样中，洗去微量粪液，洗下的粪液在显微镜下观察，每个粪样做3个载玻片，若发现华支睾吸虫虫卵，即为阳性；没有发现虫卵则为阴性。将阳性粪便进行收集。 　　1.2.2 虫卵的收集 用沉淀集卵法收集虫卵。先将每个粪样中加入1 000 mL蒸馏水充分搅拌溶解，用40目筛过滤，除去滤渣后，滤液中再加入500 mL蒸馏水进行溶解搅拌，再用260目筛子进行过滤；滤液中再加入300 mL蒸馏水进行溶解搅拌，充分沉淀后，去上清液，留取沉淀，如此过程进行，依次降低蒸馏水的用量，直到上清液澄清，最后留取沉淀量20 mL，分装到2 mL EP管中，于-20 ℃保存。 　　1.2.3 虫卵DNA的提取 按参考文献[7]的方法并进行了适当改进。将冰冻的含虫卵的粪便样品取出，于清水中融化，放入沸水中煮10 min， 12 000 r/min离心5 min，除去少量上清液后，将剩余的液体和沉淀移入2 mL的EP管中，并重悬；将EP管放入沸水中煮5 min， 12 000 r/min离心5 min；去上清液，各管中分别加入2% Triton X-100及KOH各200 μL，振荡器振荡混匀，12 000 r/min离心5 min，去上清液，再加2% Triton X-100及KOH各200 μL反复进行此过程，直至上清液变清澈；去上清液，每管加入800 μL蔗糖/KCl溶液，并充分振荡均匀后， 12 000 r/min离心8 min；将上清液移入新的2 mL EP管中，蒸馏水加满，12 000 r/min离心10 min，去上清液，重复加满蒸馏水，清洗沉淀，至最后残留200 μL沉淀物及液体；用组织匀浆机匀浆残留的沉淀物及液体； 12 000 r/min离心5 min，留取上清液并移入新管中，沸水煮5 min，作为PC