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吉林市左家地区珊瑚菌遗传多样性AFLP分析 　　摘要：以吉林市左家镇3个地区的18株野生珊瑚菌样品为研究材料，应用AFLP分子标记方法，分析其遗传多样性水平。结果发现，左家地区珊瑚菌具有较高的遗传多样性，AFLP多态位点百分率为85.4%，遗传距离在0.223～0.712之间，相似系数的变化范围在0.442～0.824之间。应用UPGMA聚类分析表明，所检测的18株野生珊瑚菌样品的遗传距离与采样地点有明显关联，并且ZJ居群野生珊瑚菌的遗传多样性远高于LT居群和FM居群。 　　关键词：珊瑚菌；AFLP；遗传多样性；遗传分化 　　基金项目：吉林农业科技学院微生物学重点学科培育项目（吉农院合字〔2013〕第X009号）；吉林农业科技学院大学生科技创新项目（吉农院合字〔2015〕第 041号） 　　中图分类号： Q75 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.03.022 　　珊瑚菌（Clavicorona pyxydata），也称“扫帚菌”，属珊瑚菌科（Clavariaceae），其形状多样，颜色鲜艳，是我国野生食用菌中的一种重要资源。而传统医学认为，珊瑚菌具有补钙、镇静的食补功效。有研究表明，珊瑚菌具有抗癌作用，珊瑚菌的水煎剂对体外培养的乳腺癌细胞株有明显的抑制作用，可以作为抗乳腺癌的良好备选药物。珊瑚菌在我国分布广泛，其中常见种有葡萄枝瑚菌、密枝瑚菌、杯珊瑚菌、冠锁瑚菌、须瑚菌、棒瑚菌、平截棒瑚菌等。由于珊瑚菌的高经济价值而且目前尚不能进行商业化栽培，因此目前市场上消费的产品几乎全部来自野生。目前，国内仅对山东省、河南省、秦巴山区和鸡足山地区的野生珊瑚菌进行了资源调查，而有关珊瑚菌遗传多样性结构状况研究尚未开展。在众多分子生物学遗传多样性研究方法中，AFLP分子标记技术具有实验操作简单、快速、高效、遗传多态性高、重复性好等特点，其检测遗传位点效率高于ISSR和SSR等技术。通过AFLP位点遗传多样性分析，可以检测居群的遗传多样性水平；通过遗传多样度、基因多样度各指数的分析可以了解居群的遗传结构和遗传分化；分析群体间的遗传相似性和遗传距离；通过聚类分析获得显示各居群间亲缘关系的进化系统。本研究运用AFLP分子标记技术在分子水平上探讨吉林市左家地区18株的珊瑚菌亲缘关系和遗传多样性，旨在揭示珊瑚菌遗传多样性水平，遗传结构及其遗传分化，为珊瑚菌这一重要食（药）用资源保护与利用奠定理论基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　从吉林市左家镇三个地区采集18株野生珊瑚菌子实体（三个居群，分别编号为LT1-6，FM1-6和ZJ1-6），样品采集后用硅胶干燥并置于密封袋中。 　　1.2主要试剂 　　AFLP接头、预扩增引物和选择性扩增引物由上海生工公司合成；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP和DNA ladder Mix购自Takara公司。 　　1.3珊瑚菌总DNA 的提取 　　称量珊瑚菌子实体干燥样品0.2克，采用改良的CTAB法[7]提取珊瑚菌基因组DNA，加100μL的TE缓冲液溶解总DNA，-20℃冻存备用。 　　1.4 AFLP扩增 　　1.4.1 酶切与接头连接 酶切反应体系为1×T4 ligation buffer，1U EcoRI，1U MseI，100μmol/L EcoRI接头，100μmol/L MseI 接头，1U T4 ligase，200ng基因组DNA，加水补足到总反应体积为30μL。混匀反应体系，在37℃条件下酶切4 小时，继续在16℃条件下连接8 小时后4℃保存。 　　1.4.2预扩增和选择性扩增 本文所用的预扩增引物和荧光标记的选择性扩增引物由Invitrogen公司合成。预扩增反应体系为25μL，包括1×反应缓冲液，300μmol/L dNTPs，350μmol/L引物，0.5U ExTaq DNA聚合酶，1μL基因组DNA酶切产物作为模板。PCR反应条件为95 ℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，35次循环，72℃延伸10min，4℃保存。预扩增PCR反应产物稀释20倍作为选择性扩增PCR的模板。选择性扩增反应体系为25μL，包括1×反应缓冲液，300μmol/L dNTPs，350μmol/L引物，0.5U ExTaq DNA聚合酶，1μL稀释好的预扩增产物作为模板。PCR反应条件为95 ℃预变性5分钟，94℃变性45秒，65℃退火45秒，72℃延伸90秒，10次循环，每轮循环温度递减1℃，94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，35次循环，72℃延伸10分钟，4℃保存。反应产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳 80 V电压下电泳60 分钟，用凝胶成像系统观察照相。