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启动子陷阱技术在植物启动子克隆研究中应用 　　摘 要 启动子陷阱技术是一种报告基因的随机整合技术，现已成为基因功能研究中的重要手段。从启动子陷阱技术的原理、启动子陷阱报告基因的种类、启动子陷阱在植物中的应用及在应用过程中存在的问题等方面进行综述，并针对有关问题进行讨论和展望。 　　关键词 启动子陷阱 ；T-DNA ；报告基因 ；功能研究 　　分类号 Q75 　　Application of Promoter-trap in Promoter Cloning Research of Plants 　　LI Ji HUANG Tiandai HUA Yuwei HUANG Huasun 　　（Rubber Research Institute， CATAS / 　　Key Laboratory of Rubber Biology， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737） 　　Abstract Promoter-trap is a random integration of a reporter gene constructs， which provides extremely powerful tools for gene functional research. In this review， the cloning method of promoter， the principle of promoter trap， the choice of reporter gene， and the applications and the questions of promoter-trap were described in detail， In the end， the related problems with prospect were discussed. 　　Keywords promoter-trap ； T-DNA ； reporter gene ； functional research 　　启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因的上游。目前常用的启动子克隆方法有利用启动子探针载体筛选启动子[1]、PCR法克隆启动子[2-3]及启动子陷阱技术[4-6]等。虽然启动子探针法不需知道具体的基因序列，并且能获得大量的启动子片段，但整个过程工作量大，费时费力。PCR法克隆启动子操作简单、便捷，但必须以已知的基因序列或基因片段为前提。启动子陷阱方法依赖于报告基因的表达来鉴定基因及其启动子，因此不需要已知突变表型和基因序列，广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中[7-10]。通过建立高效稳定的启动子捕获系统，构建包含报告基因随机插入整个基因组的个体突变体库，已成为当前未知序列基因启动子克隆的常用方法之一。 　　1 启动子陷阱技术的原理 　　启动子陷阱（Promoter-trap）是将一个无启动子的报告基因随机插入到基因组DNA的外显子上，一旦发现其与细胞基因组中的基因被共同转录或表达，则表明该报告基因附近有启动子，从而起到以之为诱饵、发现启动子的目的。报告基因与被插入的基因及其调控序列紧密连锁，这样通过载体上的序列就很容易分离相应的启动子，而报告基因的表达模式也就反映出被插入基因所具有调控序列的特性[11]，该技术的利用依赖于报告基因的高频率、多模式表达，为在限制细胞类型表达的基因或在发育过程中短暂时间表达的基因鉴定和克隆提供了强有力的工具[9，12]。启动子陷阱的构建需要建立报告基因插入基因组的个体突变库，主要采取T-DNA和转座子系统2种方式[13-14]，而T-DNA介导的遗传转化是主要方法。构建启动子陷阱载体时，一般优先将无启动子的报告基因与T-DNA的右边界相邻，研究结果发现，具有功能的转录基因融合频率为54%，而翻译融合频率为1.6%[15]，左边界的无启动子gusA基因在不同植物中的表达频率不同[4]。转座子系统中目前只有Ac/Ds可用于基因陷阱的构建，该系统同样利用T-DNA介导的遗传转化将Ac（活化因子）插入到植物基因组中，Ac/Ds转座子具有偏好向邻近连锁位置进行转座的特性[16]，因此，不仅增加了构建突变库的工作量，而且不适合杂交困难的植物。 　　2 启动子陷阱的报告基因 　　启动子陷阱中常用的报告基因有GUS（β-葡萄糖醛酸酶）、luc（荧光素酶）、GFP（绿色荧光蛋白）和Lc（花青素调节基因）等。目前，GUS基因是最常用的报告基因，GUS蛋白相当稳定且灵敏，但底物价格较贵，且其在染色和脱色的过程中会破坏组织，不能在活体组织中进行分析[17]，这就限制了其在多种植物大规模筛选中