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地黄纤维素合酶基因克隆与生物信息学分析 　　摘要：根据以前克隆的地黄RghBNG基因碱基序列，利用Primer Premier 5.0设计特异引物，采用hiTAIL-PCR技术从怀地黄基因组DNA中扩增出578 bp DNA片段。经生物信息学分析发现，它与根癌土壤杆菌、土壤杆菌的纤维素合酶基因的同源性达81%～91%；它所含的453 bp的开放阅读框（ORF）编码蛋白质的氨基酸序列与根癌土壤杆菌、土壤杆菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌纤维素合酶基因编码蛋白质氨基酸序列的同源性高达83%～99%，说明蛋白质可能具有纤维素合酶的结构域。用hiTAIL-PCR技术克隆怀地黄纤维素合酶基因，为进一步研究其分子作用机制和在地黄分子育种中的应用奠定了基础。 　　关键词：怀地黄；纤维素合酶；hiTAIL-PCR技术；生物信息学分析 　　中图分类号：S567.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0021-03 　　收稿日期：2014-03-27 　　基金项目：河南省基础与前沿技术研究计划（编号：092300410009）；河南省教育厅科学技术研究重点项目（编号：14B180028）；国家大学生创新创业训练计划（编号：201310476102）；河南省高校科技创新团队支持计划（编号：13IRTSTHN009）。 　　作者简介：周延清（1963―），男，河南邓州人，博士，教授，主要从事遗传学教学与研究。E-mail：yqzhou@。地黄（Rehmannia glutinosa Libosch）是玄参科（Scrophulariaceae）地黄属（Rehmannia）多年生草本植物，共有6个种，广泛分布于中国、韩国和日本等地[1]。地黄在河南、山东、山西、陕西等省广泛分布，为我国大宗常用中药材之一，传统认为怀庆地黄[称为怀地黄（R. glutinosa f.hueichingensis）]质量优良[2]。地黄块根入药，富含梓醇、糖类和苷类物质、维生素、多种氨基酸、多种微量元素，具有防癌、抗癌、增强免疫力、延缓衰老、增强造血能力、降低血糖、防治糖尿病并发症等功能[3]和重要的经济价值[4]。在方剂中，地黄的使用量占了很大的比重，例如六味地黄丸、知柏地黄丸和杞菊地黄丸等。 在保健使用方面，已经开发出一些含有地黄成分的产品，如地黄精、地黄茶和地黄醋等[5]。国内外关于地黄基因克隆、功能分析和表达模式研究已有报道。例如，用RT-PCR方法扩增的地黄肌动蛋白基因片段，可用作内参基因[6]；通过RT-qPCR分析地黄中11个内参基因的mRNA表达差异情况[7]；用SSH方法克隆地黄块根中RgPR-10 基因，研究其在地黄根和茎以及原核表达情况[3，8]；利用Solexa测序技术、生物信息学和荧光定量 PCR 分析从正茬地黄和重茬地黄中鉴定出89个miRNAs，预测其中 7个新型 miRNAs的15个靶基因，在正茬地黄和重茬地黄之间构建miRNAs 差异表达谱[4，9]；进行地黄赤霉素、脱落酸和部分寡糖合成代谢关键酶基因以及扩展蛋白基因RgExpA1的克隆与表达分析[10-11]；用 PCR 技术克隆怀地黄转座酶基因[12]；此外，还进行了怀地黄RgVP和RgKAT基因的克隆和时空表达分析[13]及怀地黄3-酮酯酰CoA-硫解酶基因的克隆、序列特征和时空表达分析[14]。但尚未见克隆地黄纤维素合酶基因的报道，纤维素合成酶是将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖的一组复杂酶系的总称[15-16]。迄今为止，已有从毛竹[17]和苎麻[18]等植物中克隆纤维素合酶基因的报道。本研究根据以前克隆的地黄RghBNG基因碱基序列[19]，利用Primer Premier 5.0设计特异引物，采用hiTAIL-PCR技术[20]克隆怀地黄纤维素合酶基因序列，用生物信息学方法对其进行分析，为进一步研究其分子作用机制和在地黄分子育种中的应用奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　怀地黄85-5种植于河南师范大学生命科学学院试验田，取其新鲜块根用于提取DNA。 　　大肠杆菌DH5α菌株由笔者所在实验室保存，DNA凝胶回收试剂盒（上海生工服务有限公司）、Taq DNA聚合酶和DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司）及克隆载体pMD19-T （TaKaRa 公司），引物合成和基因测序分别由北京华大基因有限公司和上海生工生物工程技术服务有限公司完成。 　　1.2方法 　　1.2.1怀地黄基因组DNA的提取用CTAB法提取怀地黄基因组DNA，用紫外分析法和琼脂糖凝胶电泳方法检测基因组DNA的浓度、大小和纯度。 　　1.2.2引物设计与合成根据笔者所在实验室前期研究克隆的地黄RghBNG基因碱基序列（登录号为JX290370），利用