3第三课 基因工程的工具酶.pptVIP

（二） Klenow酶 该酶无5‘-3’外切活性，保留了5‘-3’聚合活性及3‘-5’外切活性。 基因工程中利用该酶：　　修复限制性内切酶造成的5突出的粘性末端　　标记DNA探针　　催化cDNA第二条链的合成　　末端终止法测序 3’ 5’ G A 新链合成方向 5’ C （三） T4 DNA聚合酶 （四）T7 DNA聚合酶　　测序酶　 （五） Taq DNA聚合酶　　耐高温，主要用于PCR反应 DNA聚合酶活性　 RNase H活性　 DNA内切酶活性　 核酸结合活性 （六）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶） 反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTTTTT 3’cDNA 3’AAAAAAAAAAAAAA 5’mRNA 5’TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18 反转录酶 Mg2+dNTP * * 第三章 基因工程的工具酶 第一节 基因工程的工具酶 第二节 DNA的切割反应 第一节 基因工程的工具酶 一、限制性内切酶（Endonucleosase） 二、 T4-DNA连接酶（T4-DNA Ligase） 三、核酸酶 四、聚合酶 五、 DNA修饰酶 一、限制性核酸内切酶（Endonucleosase） （一）限制性内切酶的发现与分类 1）限制－修饰系统： 细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰。 2）限制性核酸内切酶的类型 主要特性 I 型 II 型 III 型 限制修饰 多功能 单功能 双功能 蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2+SAM Mg2+ ATP Mg2+SAM 识别序列 TGAN8TGCT 旋转对称序列 GAGCC AACN6GTGC CAGCAG 切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游 随机性切割 特异性切割 24-26bp处 （二）II类限制性内切酶的命名及特性 命名原则 Haemophilus Influenzue 　d　　嗜血流感杆菌d株 属名　　　　种名　　株名 H i n d III　　　H i nd III　　　　 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 （三）II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点 几种最常用的限制性核酸内切酶 G↓GATCC AT↓CGAT G↓AATTC A↓AGCTT GTPy↓PuAC GGTAC↓C GC↓GGCCGC CTGCA↓G G↓TCGAC ↓GATC GGCCNNNN↓NGGCC CCC↓GGG T↓CTAGA C↓TCGAG BamHⅠ Cla Ⅰ EcoR Ⅰ Hind Ⅲ HindⅡ KpnⅠ Not Ⅰ Pst Ⅰ Sal Ⅰ Sau3A Ⅰ Sfi Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ 识别序列和切割点 限制性核酸内切酶名称 二、T4-DNA连接酶（T4-DNA Ligase） 来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，连接修复3‘端羟基和5’端磷酸基因，脱水形成3‘-5’磷酸二酯键。 三、核酸酶 作用：降解磷酸二酯键　　 分为：外切酶 内切酶 （一） Bal 31(来自于细菌 Alteromonas espejiana) 单链特异内切，双链特异外切，依赖于Ca2+　　用途：　　　构建限制酶图谱　　　产生末端缺失突变　　　DNA超螺旋线性化　 （二）E. coli外切酶III　　只降解DNA分子的一条链，产生单链的DNA分子。 （三）S1核酸酶（来源于米曲霉菌）　　特性：　　1. 降解单链DNA或RNA，降解DNA的速度大于降解RNA的速度　　2. 降解发生的方式为内