在高糖条件下锰超氧化物歧化酶刺激MSC提高血管内皮细胞活性研究.docVIP

在高糖条件下锰超氧化物歧化酶刺激MSC提高血管内皮细胞活性研究 　　[摘要] 目的 观察高糖环境下，锰超氧化物歧化酶（MnSOD）刺激间充质干细胞（MSC）上清液对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）增殖和趋化能力的影响。 方法 高糖MSC培养基条件下，100μg/L MnSOD刺激的MSC为实验组，未刺激的MSC为对照组，添加Akt阻断剂5μmol/L Tricirlbine为Akt阻断剂组，利用各组条件培养基在高糖1640培养基条件下，培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），使用MTT法观察各条件培养基对HUVEC增殖的影响，并利用细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验对HUVEC的趋化情况进行评估。 结果 与对照组相比，MSC实验组条件培养基促进HUVEC增殖；但是Akt阻断剂组HUVEC增殖能力降低；MSC实验组条件培养基作用的HUVEC趋化活动与对照组相比明显提高，但MSC实验组HUVEC趋化活动在Akt阻断剂组明显被抑制；MSC实验组条件培养基中VEGF含量比对照组明显提高。结论 高糖条件下MnSOD可以通过刺激间充质干细胞旁分泌VEGF等细胞因子对血管内皮细胞增殖、趋化等能力产生影响。 　　[关键词] 间充质干细胞；锰超氧化物歧化酶；旁分泌；人脐静脉血管内皮细胞 　　[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）13-0013-03 　　全球糖尿病患者到2035年将增加5.92亿[1]。高血糖增加活性氧，致使皮肤血管内皮细胞代谢紊乱 [2]。MSC移植到糖尿病足伤口，可以加速伤口愈合[3]，MnSOD在对抗活性氧的过程中发挥重要作用，如果利用MnSOD发挥对MSC的抗高糖损伤作用，将达到促进溃疡区血管新生之目的，促使MSC细胞疗法的广泛临床应用具有重要意义[4]。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞培养和分组 　　人骨髓间充质干细胞（MSC）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分别在正常或高糖MSC培养基中培养MSC为对照组，或添加100mmol/L MnSOD为实验组（MnSOD-MSC），添加5μmol/l Tricirlbine为Akt阻断剂组。 　　提取各组细胞上清液为条件培养基（conditioned medium， CM），分别为MSC对照组、MnSOD-MSC组、Akt阻断剂组条件培养基。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）实验分组按条件培养基而定。 　　1.2 条件培养基中VEGF、GSHPX、SOD检测 　　收集各组MSC条件培养基，使用英国Randox公司生产的ELISA试剂盒测定SOD、GSHPX和VEGF的含量。 　　1.3 细胞划痕试验 　　HUVEC接种于6孔板，0.1%FBS的RPMI-1640培养基培养24h，1000μL枪头划痕，并添加2mM羟基脲（Sigma），培养24h，采用IPP软件计算划痕面积闭合率。 　　1.4 Transwell细胞迁移实验 　　HUVEC用0.1%FBS的RPMI-1640培养基培养24h，以8×103个细胞/孔接种，放置在Transwell细胞小室内，孵箱6h，计算染色的细胞数目（100×）。 　　1.5 统计学分析 　　统计学处理采用SPSS18.0软件包，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 间充质干细胞在高糖环境下的增殖 　　正常MSC对照组的OD值为（0.913±0.344），高糖条件下，MSC对照组、MnSOD-MSC组和Akt阻断剂组的OD值分别为（0.425±0.147）、（1.261±0.579）和（0.635±0.812）。其中正常MSC对照组与高糖条件下MSC对照组、高糖条件下MSC对照组和MnSOD-MSC组、高糖条件下MnSOD-MSC组和Akt阻断剂组OD值比较，差异均有统计学意义（P0.01）。 　　2.2各组CM对HUVEC增殖影响 　　高糖条件下，MSC对照组、MnSOD-MSC组和Akt阻断剂组CM对HUVEC增殖的OD值分别为（0.824±0.176）、（1.590±0.152）和（1.073±0.294），其中前两组和后两组分别比较，差异均有统计学意义（P0.01）。 　　2.3 各组CM对HUVEC趋化能力的作用 　　MnSOD-MSC CM组和MSC CM组HUVEC划痕闭合面积分别为（0.26±0.15）μm2、（0.19±0.03）μm2，两者具有显著差异（P0.01），见图1A、B、G；Akt阻断剂CM组HUVEC划痕闭合面积为（0.17±0.51）cm2，与MnSOD-MSC CM组比较具有显著差异（P0.01），见图1B、C、G。 　　MnSOD-MS