《环境微生物学》及《大气污染控制工程》实验教案.doc

PAGE PAGE 3 三、《环境微生物学》和《大气污染控制工程》部分 实验一 水中细菌总数的测定 一、目的要求 l．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。 2．了解水源水的平板菌落计数的原则。 二、基本原理 本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。 三、器材 l．培养基：肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌水。 2.仪器或其他用具：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。 3.玻璃器皿的洗涤和灭菌 3.1玻璃器皿的洗涤 ①新购置的玻璃器皿，因含游离碱，应先在此2%盐酸中浸泡数小时，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1-2次并沥干。 ②培养细菌的玻璃器皿，应先经高压蒸汽灭菌，趁热倒出培养基，用热肥皂水或洗涤剂洗刷残渍，再用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗1-2次，沥干。 ③洗涤剂吸管量，可先置3%来苏液内浸30min或高压政策蒸汽灭菌，再用洗涤剂洗涤，用清水及蒸馏水冲洗干净。 ④洗涤染色瓶时，可在5%漂白粉中浸泡24h后，再用常规方法洗涤干净。 ⑤含油脂的玻璃器皿，应单独高压灭菌洗涤，趁热倒出污物，置100℃干燥箱内烘0.5h，再放入5%碳酸氢钠水中煮沸，先去脂再行常规洗涤。 3.2玻璃器皿的灭菌 （1）高压蒸汽灭菌 这是应用研究最广泛的灭菌方法，灭菌是用高压蒸汽灭菌锅进行。手提式高压蒸汽灭菌器，使用方便，其操作方法主注意事项如下： ①打开锅盖或从加入口处向锅内加入适量的水。 ②加水后，将待灭菌器皿放入锅内，不要塞得过紧，以使锅内温度均匀，再将锅盖盖好，拧紧螺旋，使其密封。 ③打开放气阀，打开热源加热至水沸腾，让锅内冷空气充分逸出。否则锅内温度达不到压力表所指示的对应温度，灭菌不彻底。当冷空气由排气孔排尽后，再关紧放气活塞。等锅内蒸汽压上升至所需压力时，控制热源，维持所需时间，一般为0.10343MPa(121℃)表压，保持20min。 ④灭菌完毕，关闭热源，必须待压力自然降至“0”时，方可启盖取出灭菌物品，否则易发生危险。 （2）干热灭菌 实验室中常用的还有热空气灭菌的方法，即将洗干净的待灭菌器皿均匀放入恒温干燥箱内，便不得与内层底板直接接触。关闭箱门，开户电源开关，用恒温调节器，使温度上升至160-170℃，维持2h，即可达到灭菌目的。灭菌完毕后，需关闭电源开关，待温度降至50℃以下时，方可开门取物，否则玻璃器皿可因骤冷而爆裂。 4.培养基的制备 配制一般培养基的主要程序可分为：调配、溶化、调节Ph、澄清过滤、分装、灭菌、鉴定等步骤。 ①调配：按培养基配方准确称取各成分，用少量水溶解。对于肉膏之类粘、胶状物，可盛在小烧杯或表面皿中称量，然后加水移入培养基中。此外，也可放在称量纸上称量后直接放入水中，这时如稍微加热，肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨等极易吸潮物质，在称取时动作要迅速。此外，维生素、氨基酸、无机盐等微量成分，可预先配制高深度的贮备液，在配制培养基过程中再按配方比例取一定量加入培养液中即可。 ②融化：将各成分混匀于水中，最好以流通蒸汽融化0.5h，如在电炉上融化应随时搅拌，如有琼脂成分时，应注意防止外溢。融化后，应注意补充失去的水分，补足至原体积。 制备大量培养基时，除玻璃器皿外，还可用搪瓷桶、铝锅等容器加热融化，但不可用锅或铁锅，以免金属离子进入培养基中影响细菌生长。 ③调节pH值：一般细菌用的培养pH调整在6.8-7.2之间，但也有需要酸性或碱性的培养基。培养基高压灭菌后，pH值约降低0.1-0.2，故调节时应比实际需要的pH值高0.1-0.2。但有时也可降低0.4，因所使用的灭菌器不同而不同。调节pH值，用盐酸和氢氧化钠，因为在相同pH值下，有机酸比无机更易抑制微生物生长，因此，除非特殊情况，最好不要用乙酸等有机酸来调节pH值。一般用精密pH试纸调节（精确到0.1pH单位），必要时也可酸度计。调节时需注意逐步滴加，勿使过酸或过碱而破坏培养基中某些组分。 ④过滤澄清：培养基配成后，一般都有沉渣或混浊，需过滤，使其清晰透明方可使用。液态培养基常用滤纸过滤；固态培养基如琼脂培养基，加热后需趁热用脱脂棉或多层纱布过滤。 ⑤分装：将调节pH值后的培养基按需要趁热分装于三角瓶或试管内，以免琼脂冷凝。分装量不宜超过容器的2/3，以免灭菌时外溢。分装时应注意勿使培养基粘附于管口与瓶口部位，以免沾染棉塞而滋生杂菌。 基础培养基一般常分装于三角瓶内，分装的量应根据使用目的和要求决定，但必须定量分装，以便灭菌后使用。 琼脂斜面分装量为试管容量的