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基于EST数据库葡萄APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析 　　摘要：APETALA2(AP2)是拟南芥生长发育特别是花器官发育过程中重要的调控基因。利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2基因cDNA序列作为模板，对葡萄EsT数据库进行同源检索筛选，电子克隆出葡萄AP2基因(Vv-AP2)cDNA序列。以香悦葡萄花cDNA为模板，根据电子克隆的葡萄AP2基因cDNA序列设计特异引物，分别利用RACE技术和特异PCR技术获得该基因3’末端和5’末端，序列拼接后获得葡萄的APETALA2基因的cDNA全长。该cDNA的全长为2208bp，命名为(Vv-AP2。Vv-AP2核苷酸序列有一个1536bp完整的开放读码框(ORF)，其5’与3’末端非翻译区分别为268bp和376bp。其中，3’末端含有28bp的Ploy+(A)。该基因在GenBank基因数据库的注册号为FJ809943。氨基酸推导结果表明该cDNA共编码了511个氨基酸，具备完全保守的核定位信号序列(KKSR)以及2个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT_PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR初步分析了Vv-AP2在葡萄叶、茎、花序、花等不同器官中的表达水平。其中，Vv-AP2在花序和花中的表达量明显高于叶和茎。 　　关键词：葡萄；Vv-AP2；基因克隆；表达分析 　　中图分类号：S663.1　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2010)02-207-06 　　 　　APETALA2(AP2)是拟南芥一系列调节花发育的重要基因之一。AP2编码一个转录因子，其最明显的功能是参与调控花器官和种子的发育。AP2在拟南芥的所有营养器官及种子发育的各个阶段均有表达，其不仅调控花分生组织特异性、花器官特异性、花器官数量、种子产量，而且在保持茎端分生组织中干细胞小区等方面也起着重要作用，有关其生理作用以及调控功能的研究一直受到重视。Lauter等在玉米中研究发现，AP2的同源基因(g10ssy15)在幼叶向成熟叶以及营养生长向生殖生长的转型方面具有重要调控作用。因此，该基因可能在植物的整个生长发育过程，尤其是发育阶段的转变及生殖器官的发育中发挥重要作用。目前已经从拟南芥、苹果、草莓、番茄、玉米、矮牵牛等植物中克隆到了AP2的同源基因。在矮牵牛和烟草的研究中还发现：它们的AP2同源基因与拟南芥中的AP2基因功能不尽相同，说明不同植物间AP2同源基因在功能上存在着一定的差异。在不同植物上开展AP2同源基因功能的分析对于认识基因的功能特点以及进一步利用具有重要意义。 　　葡萄(Viris vinifera)是世界性的重要果树之一，也是继拟南芥、水稻、杨树之后完成全基因测序的第4种开花植物。葡萄一直是基因组学与后基因组学研究的重要植物材料，也是分子生物学研究的重要对象。Boss等在2000年预测在将来的20年中对葡萄基因以及基因功能的认识将促进通过基因工程手段对葡萄结果能力、果实成熟期以及植株生长习性等进行更有效调控。所有这些必将对葡萄产量与品质以及田间管理的操作产生重要影响。葡萄全基因组的测序无疑为这一预测的实现提供了重要保障。在葡萄上开展AP2基因功能的分析，不仅对认识葡萄花器官发育与童期的转变等有着重要的理论价值，而且对在农业生产中更有效地利用该基因也具有重要的意义。我们采用生物信息学的方法以拟南芥AP2的基因序列为模板，对葡萄EST数据库进行反复同源筛选、延伸，获得葡萄AP2cDNA的全长序列，并以香悦葡萄花cDNA为模板，经RACE技术、电子克隆和RT-PCR技术获得葡萄的cDNA全长，命名为VvAP2，并对其核苷酸及氨基酸序列特征以及在葡萄不同器官中的表达进行了分析。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1　电子克隆 　　根据不同物种间同源基因的核酸序列相对保守的特点，在GenBank的核酸(nr/nt)数据库中检索拟南芥的AP2基因序列(U12546)，并以U12546序列为探针对葡萄属EST数据库进行BLAST检索，获得与拟南芥AP2基因同源的葡萄EST片段：从获得的葡萄EST片段中选出同源性最高的一条EV231889，再对葡萄EST数据库进行BLAST检索，得到多条与之高度同源的葡萄EST序列。将获得的EST序列用DNAStar软件进行首尾拼接，获得新的Contig，进一步将获得的Contig反复对葡萄EST公共数据库进行BLAST检索、拼接，最后获得目的基因的电子克隆全长cDNA。 　　 　　1．2　实验克隆 　　1．2．1　材料　3a生葡萄的叶、茎(茎为当年新梢顶部第2、3、4节间的茎段)、花序、花(花为未盛开的花朵)于2008年4月下旬到6月下旬采自江苏省南京市江宁区汤山果园(南京