基于VP1基因小鹅瘟病毒PCR快速检测方法建立和应用.docVIP

基于VP1基因小鹅瘟病毒PCR快速检测方法建立和应用 　　 摘要：根据GenBank公布的小鹅瘟病毒VP1基因保守序列设计了一对引物，建立了检测小鹅瘟病毒PCR方法，并对其特异性、敏感性进行了研究。该PCR方法对小鹅瘟病毒扩增结果为阳性，对照毒株扩增结果均为阴性;对小鹅瘟病毒检测的灵敏性为1pg总DNA量。以上结果表明，该PCR方法特异性强、敏感性高、简便、快速，可用于小鹅瘟的早期确诊和病毒鉴定。 　　 关键词：小鹅瘟病毒;PCR;检测 　　中图分类号：Q789 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2015）03-0031-04 　　 小鹅瘟（Gosling plague，GP）是由小鹅瘟病毒（Gosling plague virus，GPV）所引起的雏鹅的一种急性或亚急性败血性传染病。病鹅临床表现为下痢、腿瘫痪、精神萎靡、食欲废绝，主要病理学特征为小肠中后段黏膜坏死、脱落，有纤维素性渗出物凝固形成腊肠状栓子[1]。该病主要危害3～20日龄小鹅，特别是10日龄之内的雏鹅更易感染，发病率和死亡率高达100%，且传播速度快，是对养鹅业产生严重危害的一种重要传染病[2]。1956年我国科研工作者首先报道了小鹅瘟这种疾病[3]，此后世界上许多国家都有该病的报道。目前，GPV诊断方法有病毒的分离和鉴定、酶联免疫吸附试验[4]、反向间接血凝试验[5]、免疫酶琼脂扩散试验[6]和PCR方法[7]等，但是上述方法均存在不同的缺点，或检测灵敏度低，或检测时间长，或操作复杂。近年来，发展PCR检测方法具有检测速度快、特异性好、灵敏度高等优点，已经广泛应用于动物疾病的检测。笔者通过不断优化反应条件，建立了检测小鹅瘟病毒PCR方法，为小鹅瘟的临床诊断和流行病学调查提供了一种简便、快速、有效的方法。 　　1 材料和方法 　　1.1 病毒株与病料 小鹅瘟病毒、鹅副粘病毒、鹅病毒性肝炎病毒、鹅源鸭瘟病毒、鹅圆环病毒、鹅H9亚型禽流感病毒和鹅呼肠孤病毒由本实验室保存，临床检测病料为2014年采自山东省各地小鹅场临床诊断为GPV感染的小鹅的肝脏、脾脏等。 　　1.2 工具酶及试剂盒 pMD18-T载体、Premix Tag、DL2000 MarKer购自大连宝生物公司，AxyPrep体液病毒DNA小量试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司，DNA凝胶回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。 　　1.3 PCR引物设计与合成 根据GenBank中登录的GPV基因序列（AY382889），应用Primer Premier5.0软件，设计1对特异性引物，扩增GPV的VP1基因507bp部分片段。引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5′-ATGTGAGAAAGCAAACTT-3′，下游引物：5′-CTATCTATAAAGTCCTGG-3′。 　　1.4 GPV基因组DNA的提取 按AxyPrep体液病毒DNA小量试剂盒使用说明书提取GPV的DNA，并提取其它几种病毒的核酸。 　　1.5 GPV VP1基因的PCR反应条件的确立 以提取的GPV DNA作为模板，进行PCR反应，扩增VP1基因。在其它条件不变的情况下，对反应的退火温度进行优化，分别采用42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃等6种不同的退火温度进行扩增;在其它条件不变的情况下，对反应的引物浓度进行优化，分别采用0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L等6种不同引物浓度进行扩增。反应体系保持为25μl，PCR反应的条件保持不变，为95℃预变性5min，95℃ 30S、46℃ 30S，72℃ 30S ，共30个循环，最后72℃延伸10min。 　　1.6 PCR扩增产物的检测及鉴定 取5μl PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，紫外灯下观察扩增结果。如果有目的条带，则切下目的条带，按照DNA凝胶回收试剂盒的说明书操作，回收目的片段VP1。将回收后的VP1与pMD18-T连接。将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，37℃过夜培养后，挑取单菌落摇菌过夜，按质粒提取试剂盒的说明书抽提培养菌液的质粒，用建立的PCR方法检测质粒是否含有VP1基因。如果含有VP1基因，将提取的质粒发送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序结果与参照的GPV基因序列进行基因相似性分析。 　　1.7 特异性试验 分别提取小鹅瘟病毒、鹅副粘病毒、鹅病毒性肝炎病毒、鹅源鸭瘟病毒、鹅圆环病毒、鹅H9亚型禽流感病毒和鹅呼肠孤病毒等7种不同的病毒核酸作为模板，用已建立的PCR检测方法进行扩增。 　　1.8 敏感性试