课题电泳分离技术教学要求与目标目标1熟悉电泳分离技术.DOCVIP

） 课题 第八章 电泳分离技术 教学要求与目标 目标：1、熟悉电泳分离技术的原理及分类 2、熟悉常用电泳技术的操作及应用 要点：电泳分离技术的原理及操作 教具与 材料 《生物分离技术》杨昌鹏、张爱华主编 教学内容与设计： 教学目标：熟悉各种电泳分离技术特点及基本操作技术。。 知识内容：1. 电泳分离技术基本理论及分类 2. 常见电泳分离技术特点及基本操作 教学提示：影响电泳分离的因素是重点。 组织教学：点名、检查学生的出勤情况 2min 新课导入: 电泳分离技术有何特点，长处在什么地方 3 min 第八章 电泳分离技术 第一节 电泳的基本理论及分类 25 min 一、电泳的基本理论 （一）概念及原理 导出Q?E = 6πrηυ 电场强度（E），所带净电荷（Q），r是球状分子的半径，η是缓冲液黏度，υ是电泳速度 结论：迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的黏度成反比 （二）影响电泳分离的主要因素 1、大分子的性质2、电场强度3、溶液的pH 4、溶液的离子强度 5、 电渗6、温度7、支持物的影响 二、电泳的分类 （一）按分离原理分类 1、区带电泳2、自由界面电泳3、等速电泳4、等电聚焦电泳 教学提示 主板书 副板书 提问 副板书 主板书 副板书 副板书 黑龙江生物科技职业学院教案（第 页） 教学内容与设计： （二）按有无固体支持物分类 按有无固体支持物可以分为两类：自由电泳和支持物电泳。支持物电泳根据所用的支持物不同又可分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。 第二节 常用电泳分离技术 52 min 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳 （一）基本原理 1、凝胶的聚合及孔径 2、电泳效应 （二）影响凝胶聚合的因素 1.试剂质量2.凝胶浓度3温度和氧气的影响 （三）聚丙烯酰胺胶体的制备 重点讲解 垂直板型电泳的聚丙烯酰胺胶体的制作方法 （四）聚丙烯酸胺凝胶电泳的特点与用途 1.电渗作用比较小2.凝胶孔径可调3.电泳分辨率高4.化学稳定性和热稳定性好5.机械强度高 二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （一）基本原理 在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS），不影响凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于其自身分子量的大小。 主要是因为SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。同时大多数蛋白质的每个氨基酸能与固定量的SDS相结合,溶液中的SDS总量，至少要比蛋白质的量高3倍以上，大多数蛋白质与SDS按1：1.4的比例结合，形成SDS–蛋白质复合物。其结果：（1）由于SDS解离后带有很强的负电荷，致使SDS–蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差异；（2）SDS与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。 （二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶胶体的制备 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可采用垂直板型 （三）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的优缺点及应用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有设备简单，样品用量甚微，操作方便等优点，现已成为测定大多数蛋白质分子量的常用方法 教学提示 主板书 副板书 重点 副板书 副板书 画图 副板书 主板书 副板书 提问：SDS是什么？ 副板书 副板书 黑龙江生物科技职业学院教案（第 页） 教学内容与设计： 三、等电聚焦电泳 （一）基本原理 等电聚焦电泳是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，利用两性电解质形成的一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，使不同的酶或蛋白质聚焦于与其等电点相当的pH值位置而进行分离的电泳技术。 （二）pH梯度的建立 产生pH梯度的方法通常有两种：一种是用两种不同pH的缓冲液互相扩散，在混合区形成pH梯度，称为人工pH梯度。但这种pH梯度不很稳定，常用于制备电泳。另一种是利用两性电解质载体（Carrier ampholytes）在电场的作用下自然形成pH梯度，称为天然pH梯度。 （三）支持pH梯度的介质 （1）梯度溶液（2）凝胶 （四）等电点聚焦电泳的操作过程 1.pH梯度支持介质的制备2.电泳3.分离组分的检测 （五）等电聚焦电泳的特点及应用 （1）具有很高的分辨率（2）显现的区带窄（3）聚焦力强（4）可直接并准确测出等电点 等电聚焦技术的缺点是：①等电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀；②样品中的成分必须停留在其等电点处，不适用于在等电点不溶或发生变性的蛋白质 四、其他电泳技术 （