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基于EST序列甘蔗SNP发掘及分析 　　摘要：从NCBI中的EST数据库下载已公布的甘蔗EST序列28 512条，利用DNAStar软件中的Seqman程序进行叠连群构建，EST序列共构建3 449个叠连群，从中筛选出93个叠连群，长度共计105 385 bp，发现候选SNP位点 1 449个，SNP平均出现频率为1.37%，共有74个contigs含有SNP位点，平均每个contig含有19.58个SNP位点，含有SNP位点数最多的1个叠连群有229个SNP候选位点，不同的叠连群含有的SNP位点数量差异较大，但转换类型与颠换类型所占比例很接近。本研究所用的叠连群的总长度是105 385 bp，平均72.93 bp含有1个SNP位点。 　　关键词：甘蔗；NCBI；EST序列；DNAStar；SNP位点 　　中图分类号： S566.101 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0064-03 　　单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）指基因组内DNA序列在某一特定的核苷酸位置发生缺失、插入、颠换、转换等变化。作为第3代遗传标记，已在动植物遗传连锁图谱构建[1]、重要性状的基因定位[2]、多样性分析[3]以及品种鉴定[4]等相关研究中得到广泛的应用，跟以简单序列重复（SSR）为代表的第2代分子标记相比，SNP具有易于实现自动化分析、遗传稳定性强、密度高等优点。但SNP标记开发在前期测序阶段成本较高而限制了SNP相关标记的大规模开发。因此，利用已有数据，通过生物信息学进行相关分析来开发SNP标记，然后通过相关试验对候选SNP标记加以验证，已成为一种降低成本且快捷高效的SNP开发途径[5]。 　　表达序列标签 （expressed sequence tags，EST）是来源于功能基因表达的cDNA片段，是转录区域多态性识别的重要资源，随着相关研究的深入，公共数据库中的核苷酸序列中EST序列的增速最快，以EST序列为基础开发分子标记，变得越来越方便。目前，常用的EST标记有EST-AFLP、EST-RFLP、EST-SSR、EST-SNP等[6]。除了具有一般分子标记的特点，EST标记还具有通用性好、信息量大、开发方法简单快捷以及成本低等优点。因为EST序列是基因表达区的cDNA序列，所以EST序列为基础开发出的SNP位点很可能与表达基因的功能密切相关，或者直接在基因的编码区之内，可直接用于动植物分子育种等相关领域的研究[7]。而且在EST序列中，SNP频率很丰富[8]。因此，在尚未获得基因组全序列的动植物中，开发EST-SNP标记具有重要意义[9]。但NCBI中甘蔗dbEST数据库中的EST-SNP研究在国内外尚未发现相关报道，本研究利用NCBI上公布的甘蔗EST数据中筛选SNP候选位点，为甘蔗EST-SNP标记的开发以及后续的分子生物学研究奠定一定的基础。截至2014年10月，NCBI的dbEST数据库中已收录了甘蔗EST序列28万多条，如此庞大的数据为从甘蔗EST序列中开发SNP标记提供了良好的数据支持，甘蔗EST-SNP标记的开发可为甘蔗分子育种和基因组学等方面的研究提供重要的技术支持，本研究从NCBI中的dbEST数据库中下载了28 512条EST序列，利用DNAStar软件中的Seqman程序拼接得到3 449个重叠群（contigs），并将拼接结果进行人工筛选，为提高候选SNP位点的可靠度，本研究选用的EST序列拼接而成的contigs都至少含有20条EST序列，每个候选位点都至少有5条EST序列的相关位点作为支持，旨在发掘甘蔗的EST-SNP位点和寻求能得到大量可靠的候选SNP位点的筛选方法。 　　1 材料与方法 　　2014年10月13日从美国国立生物技术信息中心网站dbEST数据库（http：///nucest/？term=sugarcane）下载28 512条甘蔗EST序列，所有序列均以FASTA格式保存，未得到可靠性较高的SNP候选位点，本研究用DNAStar软件中的Seqman程序检测并去除所有EST序列的载体序列，然后组装拼接成contigs。因为本研究选取DNAStar软件进行EST-SNP候选位点的开发，因此筛选步骤主要分为以下几类：（1）在Seqman的拼接结果中提取包含20条以上EST序列的contigs，并在其中筛选候选SNP位点；（2）候选SNP位点两侧至少有5 bp碱基要完全保守为原则对候选SNP位点进行人工筛选；（3）对筛选结果进行整理、归纳、分析。 　　SNP发掘：应用Seqman程序的SNP工具查找SNP候选位点。 　　SNP频率计算：SNP频率=（候选SNP数目/contigs长度）×100%。