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壳聚糖酶产生菌选育及产酶能力研究 　　摘要：从某水产市场附近土壤中分离筛选出4株具壳聚糖酶能力的微生物菌株，其中菌株S03具有较高的产酶能力，经鉴定属于毛霉属（Mmucor sp.）。试验条件下该菌株培养3 d时，发酵液中壳聚糖酶活性最高。并进一步证明该菌株所产壳聚糖酶属于诱导型壳聚糖酶，适量添加葡萄糖有助于壳聚糖酶的产生。 　　关键词：壳聚糖酶；酶活力；鉴定 　　中图分类号： Q939.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0347-02 　　收稿日期：2013-05-07 　　作者简介：温钢（1976―），男，吉林四平人，硕士，讲师，研究方向为应用微生物。E-mail：315554062@。壳聚糖（chitosan）别称甲壳胺，是甲壳质脱去部分乙酰基的产物，是一类由2-氨基-2-脱氧-葡萄糖和2-乙酰氨基-2-脱氧-葡萄糖（40%）单体通过β-1，4糖苷键连接而成的直链多糖[1]。壳聚糖是自然界中唯一的天然阳离子高聚物，其特殊的化学结构决定了这种高聚物有着独特的生物活性。壳聚糖具有提高人体免疫力、促进伤口愈合、降血脂、降血压等保健作用，是一种有广泛应用前景的医疗保健材料[2]。另外，壳聚糖还有很好的杀菌、抑菌作用。但是由于壳聚糖分子量大，不溶于水，不易被人体吸收，从而限制了这种物质作为医疗保健品的应用。利用壳聚糖降解得到壳低聚糖，不但容易被人体吸收，而且某些壳寡聚糖还有许多新颖的生物活性，在治疗癌症和提高人体免疫力方面有很好的试验效果[3]。目前降解壳聚糖的方法主要有化学降解法和酶降解法，其中酶降解法以降解过程容易控制、反应条件温和以及对环境没有污染等优点成为壳聚糖降解的首选途径[4]，因此进一步选育壳聚糖酶产生菌株就显得尤为重要。本研究选育出具有一定产壳聚糖酶能力的菌株，并初步考察了其产酶能力，以期为后续壳聚糖酶发酵生产及应用研究奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　壳聚糖和氨基葡萄糖购于国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。 　　胶体壳聚糖：取5 g壳聚糖加入100 mL 0.4 mol/L HCl溶液中，50 ℃搅拌至壳聚糖完全溶解，加入1 mol/L NaOH溶液调节pH值至5.0，得5%胶体壳聚糖。 　　1.2培养基 　　胶体壳聚糖液体培养基：A液：1%胶体壳聚糖；B液：04% K2HPO4?3H2O，0.2% KH2PO4，0.14% MgSO4?7H2O，0.1% NaCl，0.1% KCl，0.02% CaCl2，0.1%酵母粉，3%琼脂，pH值7.2；将A液、B液分别灭菌后等体积混合。 　　壳聚糖粉末培养基：1%壳聚糖粉末，0.07% K2HPO4?3H2O，0.03% KH2PO4，0.05% MgSO4?7H2O，0.03%蛋白胨，0.03%酵母粉，pH值7.2。 　　1.3方法 　　1.3.1菌株初筛将采集土样加入适量蒸馏水摇匀，梯度稀释后，涂布于胶体壳聚糖固体培养基平板上，30 ℃培养3～5 d，逐一挑取平板上生长状况良好且能够形成水解圈的菌株，再次接种于胶体壳聚糖固体培养基平板，测定菌落直径和透明圈直径，进一步比较菌株利用壳聚糖的能力。将分离所得菌株分别编号，进一步参考相关文献[5]进行菌种鉴定。 　　1.3.2菌株降解能力考察将菌株接种于壳聚糖液体培养基中，接种后于150 r/min、30 ℃振荡培养，定时取样，12 000 r/min 离心10 min后得粗酶液，采用DNS法测定壳聚糖酶活性[6]。具体方法为：在0.5 mL粗酶液中加入磷酸缓冲液（pH值7.2）1.0 mL和1%胶体壳聚糖0.5 mL，混匀后于46 ℃保温30 min，沸水浴10 min。4 000 r/min离心5 min后，取2 mL上清液与1 mL DNS试剂混合，沸水浴中反应5 min后冷却至室温，加入4 mL去离子水，混匀后于540 nm处测定吸光度，并根据氨基葡萄糖标准曲线计算壳聚糖酶活性。 　　酶活性单位的定义：pH值 7.2、温度46 ℃时，1 mL样品1 min催化生成1 μmol氨基葡萄糖的还原糖量所需的酶量为1个酶活单位（U/mL）。 　　1.3.3菌株生长曲线的测定将菌株接入液体培养基中培养，定时取样，测定菌体干重和发酵液酶活性，考察菌株生长曲线和酶活性随时间变化的规律。 　　1.3.4其他影响菌株产酶能力因素的考察 　　不同碳源对产酶诱导的影响在液体培养基中，分别以1%壳聚糖粉末、1%胶体壳聚糖、1%甲壳质、1%可溶性淀粉、1%葡萄糖、1%蔗糖、1%壳聚糖粉末+0.1%葡萄糖、2%壳聚糖粉末+0.1%葡萄糖、5%壳聚糖粉末+0.1%葡萄糖、1%壳聚糖粉末+1%葡萄糖作为碳源，接入菌种后150 r/min、30