组培实验设计性实验的方案.doc

正交实验法研究铁皮石斛原球茎分化影响条件 [摘要] 利用6-BA、IBA、NAA和外源添加物四个因素三水平进行L9 ( 34 )正交实验, 研究 各因素对铁皮石斛原球茎分化的影响. 对实验统计通过极差分析及均值分析, 结果表明: 当6-BA的浓度为2 mg /L、IBA 浓度为0.5mg /L、NAA浓度为0.75mg /L和外源添加物为苹果（50g/L）时, 原球茎最易于分化成丛生小苗; 影响原球茎分化程度的因素依次为6-BA浓度﹥外源添加物﹥NAA浓度﹥IBA浓度。 [关键词] 铁皮石斛；组织培养；原球茎分化；正交实验。 1 前言 1.1 目的意义 铁皮石斛( Dendrobium candidum Wall． ex Lindl． ) 为兰科石斛属多年生附生型草本植物，别名铁皮兰，因其茎节处呈黑褐色，又名黑节草[ 1]。利用石斛茎尖组织培养无病毒植株的无性繁殖技术创立以来, 石斛组织培养技术逐步走向深入化。 目前, 有关铁皮石斛的原球茎分化和生根条件的研究大都基于单因素试验, 如不同培养基、激素浓度、无机盐浓度、碳源、pH 等以及香蕉、马铃薯等附加物[2]。但是铁皮石斛原球茎分化及生根受培养基中综合因素的共同影响, 不同因子的合理配置决定着培养基的科学性和高效性. 运用正交实验设计可以精简试验次数、克服培养基配方设计的盲目性、大大提高工作效率和试验的可靠性。 1.2 研究进展 自1960年法国人Gmore l利用石斛茎尖组织培养无病毒植株的无性繁殖技术创立以来, 石斛组织培养技术逐步走向深入化. 目前, 有关铁皮石斛的原球茎分化和生根条件的研究大都基于单因素试验, 如不同培养基、激素浓度、无机盐浓度、碳源、pH 等以及香蕉、马铃薯等附加物. 运用正交实验设计可以精简试验次数、克服培养基配方设计的盲目性、大大提高工作效率和试验的可靠性. 广东省植物研究所关于籼稻花药的离体培养的报道, 还相继在兰科植物中得到了应用[3], 但尚未应用于铁皮石斛的离体培养. 本实验利用6-BA、IBA、pH 和培养基种类、琼脂浓度、KCl浓度各三因素三水平及空白对照分别设计两套L9 ( 34 )正交实验[4], 以期分别得到有利于铁皮石斛原球茎分化和生根的理想培养基配方. 在20 世纪70 年代，谭文澄等就进行铁皮石斛兰组织培养研究并获得完整植株。到今天，铁皮石斛的组织快繁依然是热点。归纳起来，当前铁皮石斛的组织快繁可分为种子无菌萌发、试管苗原球茎发生和试管苗器官发生3 种途径。 袁正仿等将铁皮石斛带茎节的茎段接种于培养基上( N6 + 2．5 mg·L － 1 BA) 诱导茎节发芽，再将芽接种于培养基上( N6 + 2．5 mg·L － 1 BA + 0．5 mg·L － 1 IBA) 诱导出原球茎，并指出只有将诱导出的小植株再诱导，诱导出大量的原球茎，才能扩大其繁殖。秦廷豪用铁皮石斛茎段、带顶芽的茎段和根蔸3 类外植体在培养基上( MS + 0.5 mg·L － 1 6-BA + 0．2 mg·L － 1 NAA) 培养，仅根蔸能诱导出原球茎。王春等研究表明，铁皮石斛原球茎诱导最佳培养基为1 /2 MS + 1.0 mg·L － 1 BA + 0.5 mg·L － 1 NAA，诱导率为58%。王丽萍等研究表明，选用铁皮石斛幼嫩茎段为外植体诱导出原球茎的最佳培养基为MS + 0.5mg·L － 1 6-BA + 0.5 mg·L － 1 NAA + 1.0 mg·L － 1 2，4-D。郑宽瑜等.以铁皮石斛种子为外植体诱导出原球茎。苏钛等.研究表明，BA 相对于其他激素对铁皮石斛原球茎诱导效果最好，以2.0 mg·L － 1 BA 诱导率最高[5]。 周俊辉等研究表明，以1.0 mg·L － 1 NAA 诱导铁皮石斛生根效果最明显。袁正仿等将铁皮石斛原球茎接种在分化培养基上( N6 + 1.5 mg·L － 1 BA + 1.2 mg·L － 1 NAA + 5%香蕉汁) 诱导原球茎分化，结果表明，添加一定浓度的土豆汁、香蕉汁有利于原球茎分化，且添加浓度直接影响分化率和分化时间; 用N6 + 2.5 mg·L － 1 NAA + 10%香蕉汁培养基使苗快速长高，把长高的苗转接到培养基上( N6 + 2.5 mg·L － 1NAA + 10%土豆汁) ，使茎变得粗壮[6]。徐雪荣等研究表明，铁皮石斛原球茎最佳分化培养基是MS + 0.3mg·L － 1 6-BA + 3.0%白糖，分化率为74%; 分化出的丛芽接种在生根培养基中( MS + 0.05%AC + 3.0%白糖) ，28d 生根率达到87%。朱艳等研究表明，铁皮石斛丛生芽在培养基上( 1/2 MS + 10% 香蕉汁+0.5%AC) 生根效果最好。林丛发等研究表明，最适于铁