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大豆异黄酮高效液相色谱法研究 　　[摘 要]本文建立了同时测定四种大豆异黄酮（大豆苷、大豆苷元、染料木素和染料木苷）含量的高效液相色谱法方法。采用日本岛津LC10AT高效液相色谱仪测定：色谱柱为安捷伦 Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm 5μm），采用甲醇?s乙腈?s磷酸水（pH=3.0）=30?s10?s60洗脱，流速为：1.0mL/min，波长：260nm，进样量：10μL，柱温：30℃。四种大豆异黄酮在20～400μg/mL线性关系良好。加标回收率分别达到90%以上，方法简便、灵敏、准确，适用于大豆异黄酮成分的含量测定。 　　[关键词]高效液相色谱法； 大豆异黄酮；含量测定 　　中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）06-0197-02 　　曾经1999年10月FDA发布了第11个健康声明：每人每天食用25g黄豆，可以减少发生冠心病的风险。而近年来一些研究表明，大豆及豆制品具有更加广泛的生物功效，如抗肿瘤、防治骨质疏松和增强记忆等，这些功能均与大豆异黄酮有关。大豆异黄酮与防治一些和雌激素水平下降有关的疾病，延缓女性衰老、改善更年期症状、骨质疏松、血脂升高、乳腺癌、前列腺癌、心脏病、疏松症、心血管疾病等。 　　大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，是生物黄酮中的一种，也是一种植物雌激素。它主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，种皮中含量极少。80%～90%的异黄酮存在于子叶中，浓度为0.1%～0.3%。胚轴中所含异黄酮种类较多且浓度较高，为1%～2%，但由于胚只占种子总重量的2%，因此尽管浓度很高，所占比例却很少（10%～20%）[1-3]。迄今为止，共发现有12种成分，分为游离型的苷元和结合型的糖苷两类。苷元占总含量的2%～3%，包括软料木黄酮、黄豆苷元和黄豆黄素3种[4]。糖苷9种，以葡萄糖苷、乙酰基葡萄糖苷、丙二酰基葡萄糖苷3种形式存在，其中染料木苷、黄豆苷、丙二酰金雀异黄苷、丙二酰大豆苷4种成分约占总量的83%～93%[5]。 　　目前国内外测定大豆异黄酮的方法主要有比色法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法（GC） 、紫外分光光度法和高效液相色谱法（HPLC）等。但紫外分光光度法常以染料木苷标准品来表征大豆异黄酮总浓度，该方法虽然简便易行、成本低廉但仅适用于粗略测定异黄酮总量，结果有一定偏差[6]。薄层色谱法具有取样量少，操作简单、分离效果好等优点，但其薄层显色剂用量难于准确控制，人为误差大。康纯[7]等以6种SDS、正丁醇、正庚烷、水微乳液作展开剂，通过聚酰胺薄层色谱法分离和检测13种黄连药材、饮片及中成药，并且观察了微乳液类型副I分辨率的影响，结果表明，含水量75%的微乳液为适宜的展开剂。GC 法采用了样品衍生后进行测定，存在操作烦琐，条件不易控制、杂质干扰严重等问题；高效液相色谱法则具有样品不需要预处理、测定快速、定量准确的优势。本研究采用高效液相色谱法（HPLC），甲醇?s乙腈?s磷酸水（pH=3.0）=30?s10?s60作为流动相，同时对大豆异黄酮4种主要成分大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素进行分离定。 　　1 实验部分 　　1.1 仪器和试剂 　　岛津LC10AT高效液相色谱仪：附带SPD-10A紫外检测器，色谱柱为安捷伦 Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm 5μm），0.45？m微孔滤膜过滤器，JP-030S型超声波清洗器，TU-1810紫外-可见分光光度计，BSA224S-CW分析天平。大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量均≥98%，且均购置于曼思特生物科技有限公司。乙腈色谱纯，甲醇色谱纯。样品大豆异黄酮软胶囊购置于深圳医药公司。 　　1.2 标准溶液制备 　　1.2.1 大豆异黄酮标准贮备溶液：称取大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素各1mg，置于25mL容量瓶中，加入适量甲醇，经超声处理10min，再用甲醇定容至刻度，制成400μg/mL标准溶液。 　　1.2.2 大豆异黄酮混合标准使用溶液：吸取1.2.1中标准贮备液，配成200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，20μg/mL的混合标液，使用甲醇定容。 　　1.3 供试液制备 　　胶囊去壳，将内容物混合均匀，称取样品0.05g-0.5g（精确至0.1mg），加入适量80%乙醇。超声提取30min，加水定容，离心分离5-10min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后，收集滤液待测。 　　2 结果与分析 　　2.1 色谱条件确定 　　2.1.1 检测波长选择 　　通过紫外扫描，可知四种大豆异黄酮在260nm处均有较大吸收，故选取检测波长260nm。 　　2.1.2 流动相的选择 　　分别采用甲醇-水