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IGEM PKU Count Group bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo 分子实验基本操作培训 余涛，郑勤思 2008-4-13 Outline 分子实验基本流程介绍 分子实验基本操作的原理、步骤及注意事项 总结 分子实验基本流程介绍 感受态的制备 PCR克隆目的片断 酶切及酶切片断回收（电泳） 连接 小提质粒并酶切鉴定（电泳） 大肠杆菌的培养 转化 分子实验基本流程介绍 感受态的制备 PCR克隆目的片断 酶切及酶切片断回收（电泳） 转化 连接 小提质粒并酶切鉴定（电泳） 大肠杆菌的培养 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 原理 大肠杆菌在37 ℃下在较好较快的进行增殖， 4 ℃下则可较好停止代谢，便于保存。（长期保存应在-80 ℃ 用15-20%甘油冻存） 由于转入的质粒带有抗性标记，用带有抗生素的培养基即可进行选择性培养。 分为固体培养基培养和液体培养基培养 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 Step0: LB培养基的配制(1L培养基含) 10g Tryptone 5g Yeast Extract 10g NaCl 15g Agar (仅在固体培养基中加入，注意琼脂为Agar琼脂糖/Agarose区分) 1L 去离子水 一般一瓶配100-300mL Step0’: 灭菌（此后一切保持无菌操作） 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 固体培养基培养 （用于筛选或短期保存菌种） Step1: 倒板 微波炉加热培养基 - 室温冷却至60 ℃左右 - 移入超净台，加入抗生素（1000*的，即需稀释1000倍），摇匀 - 趁热快速倒入平板，12mL/板 - 超净台内室温冷却凝固 Step2: 接种 划线法：烧红接种环 - 冷却 - 蘸上菌液 - 在平板上划线 -灼烧接种环。 多用于菌种保存 平铺法：用玻璃刮刀将菌液铺干与平板上，多用于转化 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 固体培养基培养 Step3：37℃培养箱中培养。注意需要先正置10min（防菌液倒流）再倒置培养（防止染杂菌）。注意培养时间不可过长，一般不超过16小时，防止突变株产生。 Step4：培养结束后，需放入4 ℃冰箱的，为防止染杂菌，最好用parafilm封口。 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 液体培养基培养（用于扩增） Step1：取出适量培养液于锥形瓶或试管。 Step2: 加入适量抗生素。 Step3：将目标菌落挑入培养液。（可用接种环或枪头） Step4: 将培养液放入37 ℃摇床中培养，转速一般为220rpm。（为什么要摇？） 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 注意事项： 无菌操作！！！ 抗生素加入的时机及量 培养时间（不可过长） 返回 分子实验基本操作——感受态的制备 原理： 感受态 - 可接受外来DNA的状态 CaCl2法制备 – Ca2+可以使膜骨架发生改变，产生膜 上的小孔洞，并可使DNA分子结合并进入细胞内。 步骤：比较麻烦，属较考验分子操作的实验之一。往往大批量制备，因此不需经常进行。 注意事项：感受态制备后应立即冻存于-80℃。使用时不可反复冻融。 返回 分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收 原理： 限制性内切酶： 1）发现于细菌中，用于降解噬菌体的DNA；宿主自身的DNA则被甲基化。 2）分为I、II、III类。常用II类（识别位点与酶切位点一致） 3）区别与外切酶活性（内切酶彻底切断DNA双链，外切酶只切其中一链，往往用于DNA复制的实时检验。） 分类：单切和双切 IGEM PKU Count Group bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo bhj oo