STAT3持续激活抵抗吉非替尼的作用及机制研究-微生物与生化药学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 STAT3 持续激活抵抗吉非替尼的作用及机制研究 摘要 肺癌是当前世界各国常见的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的 75%~85%，针对晚期 NSCLC 的治疗，目前已经开始从传统化疗药物治疗转变到 分子靶向治疗的新阶段。吉非替尼（Gefitinib）是晚期 NSCLC 治疗的首个靶向 药物，具有特异性好，起效快，不良反应少的特点。虽然吉非替尼对 NSCLC 患 者显示出较好的治疗效果，但由于耐药问题的存在严重限制了本药的应用。 STAT3 是信号转导转录活化蛋白家族（Signal transducers and activators of transcription，STAT）的一员，广泛表达于不同类型的细胞和组织中，介导多种 细胞因子信号向细胞核内传导，影响众多靶基因的转录。有报道称，STAT3 的 siRNA 或抑制剂如 JSI-124、AG490、Stattic 等，通过抑制 STAT3 激活，增强了 NSCLC 细胞对吉非替尼的敏感性，改善了吉非替尼在 NSCLC 细胞中的作用。 但是，STAT3 介导吉非替尼耐药的机制还不是很明确，需要进一步研究。 本文选用几种非小细胞肺癌细胞株，观察吉非替尼作用后对细胞中 EGFR 和 STAT3 活性的影响，并采用 Western blot、RNA 干扰、免疫共沉淀等方法深入研 究 STAT3 抵抗吉非替尼作用的机制。 第一部分 STAT3 持续激活抵抗吉非替尼的作用 本部分的实验主要是在细胞水平上比较了几种非小细胞肺癌中 STAT3 的活 性，并观察吉非替尼作用后对几种非小细胞肺癌中 EGFR 及 STAT3 活性的影响。 结果表明在带有 EGFR 突变的 H1975、HCC827 细胞中 STAT3 的活性明显强于 EGFR 野生型的 A549 细胞。虽然吉非替尼能够显著抑制 H1975、HCC827 以及 A549 细胞中 EGFR 的磷酸化，然而在相同的浓度及时间下吉非替尼对这三种细 胞中 STAT3 的 705 位酪氨酸的磷酸化并没有显著的抑制作用。提示，STAT3 的 异常活化可能影响吉非替尼的作用。同时联合运用 STAT3 的抑制剂 Stattic 和吉 非替尼后能够显著增强吉非替尼抑制 H1975 细胞增殖的作用。进一步证明 STAT3 持续激活影响了吉非替尼在 H1975 细胞中的作用。 I 第二部分 STAT3 持续激活抵抗吉非替尼作用的机制 1、EGFR 突变对 STAT3 抵抗吉非替尼作用的影响 本文成功稳定转染了表达 EGFR 外显子 20 插入突变的 NIH 3T3 细胞株。随 后利用 Western blot 检测发现稳定转染的 NIH 3T3 细胞中过表达的 EGFR 促进了 p705-STAT3 的磷酸化，且发现这种活化的 STAT3 可以被吉非替尼所抑制。说明 STAT3 持续激活抵抗吉非替尼的作用具有细胞选择性。 进一步利用 RNA 干扰 EGFR 研究 H1975 细胞中 EGFR 对 STAT3 活性的影 响。发现当 EGFR 的 shRNA 转染 H1975 细胞后，EGFR 表达减少，相应的 STAT3 的 705 位的磷酸化的水平出现明显下调，表明 STAT3 持续激活抵抗吉非替尼的 作用与 H1975 细胞中 EGFR 自身分子表达有关。 2、Gp130/JAK 信号通路对 STAT3 持续激活的影响 Gp130/JAK 信号通路是激活 STAT3 的主要通路，本部分实验比较了 A549、 H1975 细胞中 JAK1 与 JAK2 的活性，发现这两种细胞中 JAK1 与 JAK2 的活性 没有显著性的差异，但是发现 H1975 细胞中 JAK1/JAK2 异二聚体的形成明显多 于 A549 细胞，这可能是 H1975 中 STAT3 高活化的一个因素。进而检测 JAK1 与 JAK2 上游 gp130 受体对 STAT3 活性的影响，发现在 H1975 细胞中利用 RNA 干扰敲除 gp130，相应地阻断了 STAT3（Y705）的磷酸化，表明 STAT3 持续激 活抵抗吉非替尼的作用与 H1975 细胞中 gp130 表达有关。 Gp130 是细胞因子的膜上受体，介导 gp130/JAK/STAT3 信号通路传导，促 进 STAT3 的激活。因此利用细胞因子芯片首先检测了 H1975 细胞中一些细胞因 子的表达水平，发现在 H1975 细胞分泌上清中只有 IL-6 与 STAT3 的联系最为密 切。为了发现其它的可能影响 STAT3 激活的细胞因子，利用放线菌酮作用 H1975 细胞，发现其条件培养基不能阻断 H1975 细胞中 STAT3 的激活。然而 FBS（含 IL-6）以及外加