TIPE2介导的DNA损伤反应在HCV致癌过程中的作用-生物学、微生物学专业论文.docxVIP

关于学位论文独立完成和内容创新的声明 本人向河南大学提出硕士学位申请。本人郑重声明:所呈交的学位论文是 本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的几解。据我所知，除 文中特别力。以说明、标注和致谢的地方外，论丈中不包括其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的回事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 f1‘… 学位申请人(学位论文件)签名:王盈 : 20 1夕年才月四 日 关于学位论文著作权使用授权书 a 本人经河南大学审核批准授予硕士学位 。作为学位论文的作者，本人完全 了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求， r 河南大学有权向国家 图书馆、科研信息机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文(纸质文 本和电子丈本)以供公众检索、查阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校 学术发展和进行学术交流等目的，可以采取彰印、缩印、扫描和拷贝等复制手 段保存、汇编学位论文(纸质文本和电子文本)。 (涉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书) 学位获得者(学位论文件)签名: 主盈 20 Ir年 5月 (g 日 学位论文指导教附: 互 zf己 20 I_t-年切77日 摘 要 背景 新型免疫调控因子 TIPE2 (Tumor necrosis factor –alpha-induced protein 8-like 2)是一 种在炎症反应及免疫自稳过程中不可或缺的负性调控因子。先前发现 TIPE2 在小鼠体 内的下调通常会导致致命性炎症。随着研究的进一步深入，有报道称 TIPE2 在人体内 往往和自身免疫性疾病相关，主要表达于免疫组织和细胞中；在一些非免疫组织及细 胞中也发现有表达，包括肝细胞，神经细胞，以及宫颈、胃肠道的上皮细胞等，提示 在人体的非免疫器官及细胞中，TIPE2 也可能具有一定的调节作用。 目的 阐明 TIPE2 在 HCV 感染后诱导肿瘤形成过程中所起的作用及分子机制。 方法 TIPE2 与肝癌关系的确认 1.1 收集 HCV 阳性肝癌病人标本,包括癌组织及癌旁组织,利用 Western blot 比较 TIPE2 的表达差异。 1.2 以肝癌细胞系 Huh7 及正常肝细胞系 Changliver 为研究对象，分别建立 TIPE2 过表达及 TIPE2 沉默稳定株，继而进行生长曲线描绘、克隆形成实验、划痕实验等检 测 TIPE2 对肝癌细胞、正常肝细胞的增殖、克隆形成能力及划痕愈合能力等的影响。 1.3 将上述建好的稳定株对裸鼠进行腋下注射，观察裸鼠成瘤情况。 .探讨 HCV 对 TIPE2 的调节作用 2.1 在 293T 细胞中将 TIPE2 分别与 HCV 编码蛋白（包括 NS3/4A、NS5A、NS5B 等）共转染，48h 后 Western blot 检测哪个（些）编码蛋白对 TIPE2 的表达有影响。 2.2 在 293T 细胞中，将上述对 TIPE2 表达有影响的 HCV 编码蛋白与 TIPE2 共转 染，利用免疫共沉淀和免疫荧光-激光共聚焦检测 TIPE2 与这些蛋白的相互作用情况。 进一步在 Huh7 细胞中进行验证。 .检测 TIPE2 对 DNA 损伤通路的影响 3.1 将 1 中裸鼠的瘤组织进行组织切片，检测 DNA 损伤情况。 I PAGE PAGE IV III III 3.2 利用 DNA 损伤药物 HU 处理 TIPE2 过表达及 TIPE2 沉默稳定株，然后 Western blot 检测过表达、沉默 TIPE2 对 DNA 损伤/修复通路中关键蛋白 H2AX、Chk1、Chk2 等的磷酸化水平是否有影响。 结果 1.HCV 阳性肝癌病人肝组织中 TIPE2 表达下调。 HCV 编码蛋白 NS5A 可以促使 TIPE2 降解。 3.HCV 编码蛋白 NS5A 与 TIPE2 可以相互作用，且在胞浆共定位。 .过表达 TIPE2 后，DNA 损伤/修复通路中的关键分子 γ-H2AX、pChk1 与 pChk2 表达明显下降；沉默 TIPE2 后，γ-H2AX、pChk1 与 pChk2 表达明显上升。 5.过表达 TIPE2 后，细胞增殖速度、克隆形成能力及划痕愈合能力显著减弱。沉 默 TIPE2 后，细胞增殖速度、克隆形成能力及划痕愈合能力显著增强。 6.裸鼠皮下注射 TIPE2 过表达及对照组稳定株细胞后，过表达组的成瘤能力明显 不及对照组；注射 TIPE2 沉默及对照组稳定株细胞后，沉默组的成瘤能力高于对照 组。 7.检测上述瘤组织中的 DNA 损伤情况，发现 TIPE2 过表达组未出现阳性着色颗 粒，几乎不存在 DNA 损伤，而其相应的对照组