TBSV病毒瞬时表达载体的构建及其表达初步研究-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

I I 摘 要 随着基因工程技术的发展，利用植物作为生物反应器生产外源蛋白的研究因其广阔地商业前 景在世界范围内受到广泛地关注。植物RNA病毒载体表达系统是近年发展起来的一类以植物作为 反应器的、新型表达系统。作为利用植物生产外源蛋白的一个有潜力的新平台，目前已有多种植 物病毒载体的相关研究报道。但是，很难预测在已经被研究的植物病毒载体中，具体哪一种植物 病毒才是最有效的外源基因表达载体，且这些载体距理想的载体，也尚有很大的改进发展空间。 此外，当前研究表明，任何一种植物RNA病毒表达载体都不具有“全能性”，只能稳定表达很少一 部分种类的外源基因。加之，载体设计和构建过程的繁琐等因素，当前可用的植物RNA病毒表达 载体种类较少，迫切需要发展新类型的植物RNA病毒表达载体。 番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus, TBSV）是番茄丛矮病毒科（Tombusviridae）、番茄 丛矮病毒属（Tombusvirus）的典型成员。近年来，研究人员在TBSV分子生物学、病毒基因表达、 复制和重组等研究领域取得了巨大的进展，使得利用TBSV构建稳定、高效的表达载体成为可能。 TBSV具有基因组小，自然寄主范围窄但人工寄主范围广以及自身携带基因沉默抑制子基因等特 点，使得TBSV在生物安全性、对外源基因承载能力和表达的高效性上都具有其他植物RNA病毒 无法比拟的潜在优势。 本研究以植物RNA病毒番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus, TBSV）为载体构建对象，成 功构建了3个类型6个TBSV病毒表达载体（WY1-WY6）。利用农杆菌渗滤接种技术将重组病毒载 体接种烟草植物本氏烟（Nicotiana benthamiana），对它们在寄主中的表达情况进行了初步研究。 研究结果表明，接种表达载体WY1的烟草于接种后第2天就可以检测到GFP荧光信号，10-12天时 外源蛋白GFP表达量达到最高；纯化后的GFP蛋白在分子量（SDS测定）和荧光光谱特性 上与前人报道的一致，说明TBSV病毒作为瞬时表达载体可以在烟草中稳定地表达外源蛋白。我 们在试验中观察到，接种TBSV表达载体的烟草植株会表现出明显地系统性花叶症状，但在一定 时间内又不影响寄主正常的生长发育，因此我们认为，在今后的生产和研究中，这种伴随性的花 叶症状可以作为外源基因是否表达的指示标志。同时，比较研究揭示TBSV病毒编码的移动蛋白 基因（Movement Protein, MP）p22可能在TBSV侵染寄主本氏烟植株时具有不可或缺作用，此发 现对于TBSV病毒表达载体进一步改造和优化具有重大的理论和现实意义。综上所述，本研究初 步建立起了利用TBSV病毒表达载体在寄主植物烟草中表达外源蛋白的技术体系。研究结果对于 “感兴趣基因”（Gene of interested, GOI）的表达和研发，提供了一条快速高效的新途径。 关键词：番茄丛矮病毒，TBSV，病毒表达载体，瞬时表达 II II Abstract The development of plants as biofactories for the production of protein products with uses in the pharmaceutical and other industries has flourished in recent years. Plant virus-based vectors allow for the rapid, high level, transient expression of proteins in whole plants. Theoretically, expression systems based on viral vectors hold a great promise. Although many different plant viruses have been modified to function as expression vectors, it is hard to say which viral vector is the most effective one and the exploitation of viruses as vectors for expressing foreign genes still have something which should be optimized and improved. In addition, the accumulation levels of different recombinant proteins are totally diff