β-arrestin2调控前列腺素受体EP2在芍药苷抑制成纤维样滑膜细胞异常增殖的作用 药理学专业论文.docxVIP

安徽医 安徽医科大学博士学位论文 PAGE PAGE 5 FLS 异常增殖的新机制，寻找新的药物作用靶点提供理论依据。 目的：从 PGE2 受体 EP2 和 β-arrestin2 的表达分布变化特点，探讨 PGE2 诱导 FLS 异常增殖的分子机制以及 Pae 的作用；观察 EP2 选择性激动剂 Butaprost 作用下， 人 FLS β-arrestin2、EP2 受体和 cAMP 水平的动态变化，利用 siRNA 沉默 β-arrestin2 的 表 达 后 观 察 β-arrestin2 对 EP2 受体 的 调 节 作 用 和 细 胞 增 殖 的 影 响 ，揭示 β-arrestin2 在调控 EP2 受体内吞和滑膜细胞异常增殖中的作用以及 Pae 抑制 FLS 异常增殖的新机制。 方法：本课题以大鼠和人的成纤维样滑膜细胞为研究对象，利用 EP2 受体选择性 激动剂 Butaprost 为探针，观察人 FLS 被活化后 EP2、β-arrestin2、cAMP 水平的时 间变化情况，揭示滑膜细胞被活化后细胞内的分子变化规律；以 β-arrestin2 的 siRNA 为工具，明确人 FLS 中 β-arrestin2 对 EP2 受体的调控作用和对 PGE2 作用下 细胞增殖的影响。并使用 PGE2 作为刺激因子，探讨 β-arrestin2 和 EP2 受体在 FLS 异常增殖时基因蛋白表达水平和分布变化特点，Gαs 表达和活性以及 cAMP 水平 的变化，同时观察 Pae 对上述变化的影响，以进一步阐明 Pae 抑制 PGE2 引起 FLS 异常增生的分子机制。组织块培养法培养大鼠和人 FLS，波形蛋白免疫组化染色 鉴定细胞类型， MTT 法确定 PGE2 和 Butaprost 刺激 FLS 增殖的亚适浓度和最适 时间，3H-TdR 参入法和 MTT 法检测 Pae 1×10-9, 1×10-8, 1×10-7, 1×10-6, 1×10-5 mol · L-1 体外给药对 PGE2 125 μg · L-1 作用下 FLS 增殖能力的影响，放免法测定细 胞内 cAMP 浓度，流式细胞术检测 FLS 膜 EP2 受体水平，western blot 法检测 FLS EP2 和 β-arrestin2 总蛋白、胞膜蛋白的表达水平，激光共聚焦观察 Butaprost 刺激 人 FLS 0、5、10、20、30、60、120 min 不同时间点时 EP2 受体细胞分布情况， 免疫共沉淀法检测 Gαs 活性，siRNA 瞬时沉默人 FLS 中 β-arrestin2 基因表达， western blot、逆转录 PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）和实时荧光定量 PCR （real time fluorescent quantitation PCR, QRT-PCR）法鉴定干扰效果，EP2 和 β-arrestin2 mRNA 水平采用 RT-PCR 和实时荧光定量 PCR 检测。 结果： 1. β-arrestin2 对 EP2 受体内吞的调控及 FLS 异常增殖的影响 EP2 受体被 Butaprost 活化后细胞内 β-arrestin2、EP2 受体分布和 cAMP 水平的 动态变化。 Butaprost 刺激 FLS 增殖的亚适浓度为 1×10-7 mol · L-1，作用最强在 24 h 左右。 流式细胞术检测发现 FLS 0min 时细胞膜上 EP2 受体的平均荧光强度为 12.5±1.28， Butaprost 的刺激引起 FLS 平均荧光强度逐渐升高，到 20min 时最高，为 16.3±0.77， 与 0 min 时比较有显著统计学差异（p＜0.01），随后再刺激细胞的 EP2 表达又开 始减少，24h 时平均荧光强度为 10.3±0.56，较 0 min 时降低（p＜0.05）。Western blot 检测发现 Butaprost 的刺激引起 FLS 细胞膜 EP2 受体表达逐渐增多，到 20min 左右 为最多，随后 EP2 表达又逐渐减少，2h 时恢复到接近 0 min 水平，与流式细胞术 观察到的变化特点一 致。激光共聚焦显 微 镜 观 察 到 了 相 同 的 变 化 特 点 。 但 β-arrestin2 细胞膜表达在 Butaprost 刺激 20min 左右开始升高，与 0 min 比较有显著 差异（p＜0.05），随后一直呈上升趋势。细胞内 cAMP 含量在 Butaprost 刺激后逐 渐上升，30min 左右较 0min 时显著增高，随后逐渐减少，2 h 时含量低于 30min 时水平，至刺激 24 h 左右