沙巴棕提取物对肺癌细胞增殖抑制及促凋亡实验研究.docVIP

沙巴棕提取物对肺癌细胞增殖抑制及促凋亡实验研究 　　[摘要] 目的 观察沙巴棕提取物与人肺癌细胞增殖和凋亡之间的关系，并探索其作用机制。 方法 应用MTT比色法、流式细胞仪法观察人类肺癌细胞成活、凋亡情况。应用Western blot法观察PARP、CASP3、P27、CDKN1B、p-STAT3蛋白的表达情况。 结果 沙巴棕提取物以剂量依赖性的方式抑制了肺癌细胞的增殖，并通过上调PARP、CASP3、P27等凋亡相关蛋白促进凋亡。沙巴棕提取物降低了p-STAT3水平；STAT3磷酸化的一种选择性抑制剂――AG490，同样通过降低p-STAT3的水平而抑制了肺癌细胞的生长。相比于以上二者任意一种的单独治疗，沙巴棕提取物和AG490的联合治疗显著降低了肿瘤细胞的增殖（P 0.05）。 结论 沙巴棕提取物可通过促进凋亡信号和下调p-STAT3蛋白而抑制肺癌细胞增殖。这些观察可能为沙巴棕提取物诱导肿瘤生长抑制的机制研究提供有价值的参考。 　　[关键词] 沙巴棕提取物；肺癌；生长抑制；信号传导与转录激活因子；凋亡 　　[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）05（a）-0006-05 　　近40年来肿瘤发病率逐年上升，男性肺癌发病率在中国各大城市中均居癌症之首位，各种治疗方法中以手术治疗效果最好，但适于手术的肺癌仅占20%～30%[1]，且术后有60%～70%的复发转移，治疗效果不佳。目前的研究方向主要为研制肺癌的靶向治疗药物，以期提高患者预后。信号传导与转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）蛋白家族是一组可以被不同的细胞因子受体激活的相关蛋白，在细胞因子-受体相互作用的过程中充当载体，保持信号在细胞内传递的内在特异性。在这些STAT蛋白当中，STAT3由于其与肿瘤的关系较为密切，越来越受到人们的重视。 　　目前，国际上临床常用的抗肿瘤药物约80种，WHO公布49种。传统上抗肿瘤药物均根据其来源和作用机制分类，一般分为烷化剂、抗代谢药物、抗生素、植物药、激素5大类。植物来源抗肿瘤药数量很多，主要有长春碱类、喜树碱类、三尖杉酯碱类、鬼臼毒素衍生物和紫杉醇等。沙巴棕又名锯叶棕，属植物药，多项研究证实，其具有抗细胞增殖、抗肿瘤的作用[7-11]。本文通过观察沙巴棕提取物对体外培养的肺癌细胞及其STAT3相关蛋白的影响，探讨沙巴棕提取物诱导肺癌细胞凋亡的可能机制，为临床治疗肺癌提供新的途径。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　1.1.1 细胞株 肺癌细胞株H520、A549购于北京鼎国昌盛公司。 　　1.1.2 仪器、试剂和药品 沙巴棕提取物（沈阳万类生物）；以下抗体购自BD Pharmingen公司：兔抗-PARP抗体、兔抗-Caspase3抗体、兔抗-P27抗体、兔抗-pSTAT3抗体、Marker；AG470购自碧云天生物技术研究所；超低黏附盘、无菌细胞刮板、MammoCult 基础培养基、MammoCult 增殖补充、HBSS、氢化可的松以及肝素购自加拿大STEMCELL Technologies公司；流式细胞仪（FACS Calibub）购自BD Pharmingen公司；干细胞RT2 ProfilerTM PCR仪和ABI PRISM7700系统购自SABiosciences公司。 　　1.2 细胞培养 　　采用常规细胞培养方式。本实验所用细胞株均使用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液培养，细胞培养箱温度为37℃，含5%CO2。细胞生长密度为105～106/mL，2～3 d 更换1次培养液，并取处于对数生长期的细胞用于实验。 　　1.3 MTT比色法 　　在 96 孔板中分别接种肺癌细胞，每孔接种的细胞密度大约2×104/mL。分别在细胞转染后48 h向96 孔板中每孔加入20 μL MTT 溶液，然后将96 孔板置于37℃继续培养4 h以使甲瓒结晶充分形成。用移液器将上清吸掉后，在每个孔中加入150 μL二甲基亚砜以溶解甲瓒，然后将培养板置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪检测各孔在490 nm处的吸光（OD）值。肺癌细胞生长率=OD实验组/OD对照组×100%。 　　1.4 流式细胞术 　　将H520与A549对数生长期细胞（调整细胞悬液浓度为5×105/mL）2 mL加入含不同浓度沙巴棕提取物（0.5或1 μL/mL）的6孔培养板内；两个一组平行操作，无药物做空白对照；培养24 h，弃上清液；用PBS或生理盐水洗2次，1000 r/min离心5 min；采集细胞，细胞经胰