注射用替加环素无菌方法适用性实验研究.docVIP

注射用替加环素无菌方法适用性实验研究 　　[摘要]目的建立注射用替加环素无菌的方法适用性。方法用100mL 0.1%的MgCh溶液冲洗后，再用700mL pH 7.0含0.1%吐温-80的0.1%无菌蛋白胨溶液冲洗，以消除替加环素样品的抑菌活性，进行注射用替加环素的细菌及真菌的无菌验证。结果采用上述方法进行验证，6种菌的供试品与阳性对照生长状况一致。结论注射用替加环素的无菌检验，需要用100mL 0.1%的MgCl2溶液冲洗后，再用700mL pH7.0含0.1%吐温-80的0.1%无菌蛋白胨溶液冲洗。 　　[关键词]注射用替加环素；无菌检查；方法适用性；MgCh；吐温-80 　　替加环素由惠氏（Wyeth）公司研发，美国FDA于2005年6月和2006年7月批准惠氏的替加环素（Tigecycline，商品名Tygacil注射用替加环素）为治疗复杂腹腔内感染和复杂皮肤感染的一线药物，其化学结构式见图1。该品种是甘氨酰四环素类抗生素中获得批准的第一个产品。替加环素对G+菌、G-菌、厌氧菌有广谱抗菌活性，包括多重耐药性的G+菌，如MRSA、MRSE、抗青霉素的肺炎链球菌、VRE。对不同耐药机制的耐四环素致病菌同样有效，但对铜绿假单胞菌无抗菌活性。替加环素是新型甘胺酰环素类抗生素，主要与细菌核糖体30S亚基结合，阻碍氨基酸肽延长，从而抑制细菌蛋白质合成来发挥抗菌活性。他克服或限制了很多抗菌药物产生的两种主要耐药机制：外排泵和核糖体保护。避免了四环素类抗生素耐药机制对其产生作用。 　　为消除本品的抑菌活性，在无菌方法学验证中，本研究采用了多种样品处理办法，包括添加高锰酸钾溶液、硫酸铜溶液、柠檬酸钠溶液、氯化镁溶液、0.1%吐温-80等，结果表明：以高锰酸钾溶液、硫酸铜溶液、柠檬酸钠溶液处理样品，均不能有效消除本品的抑菌活性；注射用替加环素进口注册标准中采用的氯化镁溶液及0.1M的HCl溶液处理样品能消除样品抑菌活性，但验证表明，该操作中用到0.1M盐酸，对试验菌有灭活作用；0.1%吐温-80处理样品，能有效消除本品的抑菌活性，而且对试验菌无灭活作用。因而最终采用薄膜过滤法，用100mL 0.1%的MgCl.溶液冲洗后，再用700mLpH 7.0含0.1%吐温-80的0.1%无菌蛋白胨溶液冲洗。 　　1.材料 　　1.1实验器材 　　HTY-SPA型无菌隔离仓（杭州泰林生物技术设备有限公司），BKF330型全封闭集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司），LRH-250A型生化培养箱（广东医疗器械厂）。 　　1.2样品 　　注射用替加环素（规格为40mg/瓶），由丽珠医药集团研究所提供。 　　1.3培养基及冲洗液 　　培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基，均购自广东环凯微生物有限公司。培养基适用性符合《中国药典》2015版，四部（通则1101）规定。 　　冲洗液：pH7.0含0.1%吐温80的0.1%蛋白胨水溶液。 　　1.4试验用菌种 　　金黄色葡萄球菌（staphvlococcus aureus）[CMCC（B）26003]；枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]；铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]；生孢梭菌（clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]；白念珠菌（candida albicans）[CMCC（F）98001]；黑曲霉菌（aspergillus niger）[CMCC（F）98003]。菌种均来自中国食品药品检定研究院医学菌种保藏中心。 　　2.方法与结果 　　参照2015版《中国药典》方法及注射用替加环素进口注册标准。 　　2.1菌液制备 　　参照《中国药典》2015版四部通则1101无菌检查法操作，取30～35℃培养24h的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨培养物和生孢梭菌的硫乙醇酸盐流体培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释得到10～100CFU/mL的菌悬液，备用。取20～25℃培养48h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释得到10～100CFU/mL的菌悬液，备用。取20～25℃培养6d黑曲霉的新鲜培养物，加入0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液4mL洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，用含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释，得到10～100CFU/mL的孢子悬液，备用。 　　2.2试验步骤 　　因为替加环素对真菌没有抑菌活性，所以在方法?W摸索的过程中只选取细菌及厌氧菌进行验证，而且，为了降低工作量，细