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流式细胞仪分离奶牛精子性控效果试验研究 　　摘要用流式细胞仪分离荷斯坦奶牛的精液，检测在冷冻前和冷冻后分离的精子活力。同时，对不同牛群利用分离得到的性控鲜精和性控冻精进行人工输精，对其人工授精效果和性别控制效果进行观察。结果表明：分选后冻前精子活力达到0.60～0.67，分选后解冻精子活力达0.31～0.39；育成牛群性控鲜精输精的情期受胎率高于使用性控冻精输精，经产母牛群性控鲜精输精的情期受胎率高于使用性控冻精输精，但差异均不显著（P＞0.05）；使用性控鲜精、性控冻精进行人工输精，育成牛群情期受胎率高于经产母牛群，且差异显著（P＜0.05）；产母犊率差异不显著（P＞0.05）；用性控精液人工授精的奶牛早期流产率高于非性控精液，但差异不显著（P＞0.05）。 　　关键词精液分离；流式细胞仪；奶牛；受胎率；产犊率 　　中图分类号 S814.3 文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）10-0322-02 　　 　　奶牛性别控制（Sex Control）是通过人为干预或操作，使母牛按照实际需要生产所需性别后代的生物技术。通过性别控制，可以提高奶牛的繁殖效率，加快遗传育种的进程，迅速增加良种奶牛的数量，从而达到改善牛群结构、提高牛群质量、促进奶牛由数量型向质量型发展的目的。因此，性别控制对奶牛业发展有十分重要的意义[1]，性别控制必将推动奶牛业跨越式的发展。 　　目前，常见的奶牛性别控制方法有2种，即早期胚胎性别鉴定法和利用流式细胞仪进行X、Y精子分离法。利用流式细胞仪分离X、Y精子是根据细胞大小及DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理或化学性质进行细胞的筛选，也是奶牛性别控制的一条新途径，可以分离得到纯度很高的X精子和Y精子群[2]。许多学者在人工授精或显微授精之前就利用分离的X、Y精子控制其性别，因而被许多学者认为是更具有实用价值的方法[3]。该研究主要观察分离后精子的人工授精效果和性别控制效果，以期促进奶牛性别控制方法在奶牛生产中的进一步应用，为完善奶牛性别控制技术提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1精液的处理 　　将采集的精液用活体荧光染料Hoechst33342孵育染色1 h，然后进入流式细胞仪分选。分选后的精液经800 g离心10 min，去除上清液，在室温下用保存液将沉淀物按一定的比例稀释，所获得的精子悬液在4 ℃ 水浴保存2 h，然后按常规冷冻方法进行精液冷冻。试验所用精液共分2类，一类为流式细胞仪分离（即染色后分离）精液，另一类为未作任何处理的普通冷冻精液（对照组）。 　　1.2受配母牛 　　选择宿州地区及附近郊县的大型奶牛养殖小区及奶牛养殖大户进行性控精液人工授精试验。一部分为荷斯坦育成母牛，14～17月龄，体重为350～450 kg；一部分为荷斯坦成年母牛，3～5岁，一产或二产。 　　首先确定发情母牛，即静立、接受其他牛爬跨者，并确定适宜的输精时间，每天观察发情2次。在母牛发情后8～12 h，利用直肠检查确定卵泡发育侧卵巢，然后将处理后的性控精液输到卵泡发育同侧子宫角内或子宫体内[3]。在发情后60 d进行妊娠诊断。随机进行配种，在每头母牛的1个发情期只配1次，避免造成过大的损失。 　　1.3调查统计 　　详细查阅每个奶牛场的配种记录，及时登记试验母牛的产犊情况，进行性别登记。 　　2结果与分析 　　2.1精子分选结果 　　流式细胞仪分离精子的分选速度为25 000个/s，收集速度为3 000～5 000个/s，X精子分选准确率为95%以上。精子自采集后到完成性别分离约需6 h[3]。 　　2.2分离效果及其对精子活力的影响 　　使用流式细胞仪分离精子，分选后冻前精子活力达到0.60～0.67，分选后解冻精子活力为0.31～0.39，具体如表1所示。 　　2.3分离精子（鲜精与冻精）用于不同牛群的性控结果 　　对育成牛群和经产牛群用性控鲜精和性控冻精进行人工输精，育成牛群性控鲜精输精的情期受胎率（73.68％）高于使用性控冻精输精（68.18%）；经产母牛群性控鲜精输精的情期受胎率（62.07％）高于使用性控冻精输精（52.17%），但差异均不显著（P＞0.05）。无论使用性控鲜精，还是使用性控冻精进行人工输精，育成母牛群情期受胎率（73.68％、68.18％）高于经产母牛群（62.07%、52.17%），且差异显著（P＜0.05）。但产母犊率差异不显著（P＞0.05）。 　　2.4分离精液人工授精的早期妊娠及流产情况 　　从表2可以看出，对不同牛群用非性控精液和性控精液进行人工输精，使用非性控精液人工授精的早期流产率为5.13%，性控精液人工授精的早期流产率为6.48%，性控精液人工授精的早期流产率高于非性控精液组，但差异不显著（P＞0.05），属