流式细胞学检测三阴性乳腺癌生物学意义.docVIP

流式细胞学检测三阴性乳腺癌生物学意义 　　【摘 要】目的：S期细胞比率（S-Phase Fraction SPF）、倍体表达在三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌之间有无差别；方法：通过流式细胞仪检测135例乳腺SPF及倍体表达情况。结果：19例三阴性乳腺癌中SPF：9.32±4.89；116例非三阴性乳腺癌SPF：5.65±4.14；三阴性乳腺癌中二倍体6例、异倍体13例，非三阴性乳腺癌二倍体49例、异倍体67例；结论：三阴性乳腺癌的SPF值较非三阴性乳腺癌差异明显有统计学意义，而倍体表达无明显差异无统计学差异；高表达的SPF与年龄、临床分期有明显相关性，而与淋巴结有无转移、肿块大小无明显相关性。 　　【关键词】三阴性乳腺癌；流式细胞学检测；S期细胞比率 倍体表达 　　三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及人表皮生长因子受体2（HER-2）均为阴性的乳腺癌亚群。TNBC为预后最差的乳腺癌亚型，具有侵袭性强，恶性程度高、预后差等特点[1]，除化疗外尚无有效地全身治疗措施，依靠现有的临床和病理指标难以对三阴性乳腺癌患者进行最优化的个体化治疗和预后分析。 　　受体检测和阳性判定标准 ER、PR受体采用免疫组织化学法检测，阳性细胞比例≥1%判定为阳性。HER-2受体采用免疫组化与免疫荧光原位杂交（FISH）相结合的方法进行检测，阳性判定标准为：①免疫组织化学检测“+++”定义为阳性，“―”和“+”定义为阴性。②免疫组织化学检测“++”必须经FISH检测再次确定：若FISH（fluorescence in situ hybridization，FISH）为阳性则定义为HER-2受体阳性，若FISH为阴性则定义HER-2受体阴性。③免疫组织化学检测为“+++”或FISH检测阳性，两者之一阳性即可定义HER-2受体阳性。 　　流式细胞检查（flow cytometry，FCM）是20世纪70年代发展起来的对单细胞定量分析的一种新技术，它采用计算机、激光和荧光标记单克隆抗体技术，能在短期内对大量标本进行检测，具有极高的检测速度与统计精确性。而且从单一细胞可以同时测得多个参数，为生物医学与临床检验提供了一个全新视角和强有力的手段。经FCM检测后一般能获得三项参数：DNA倍体数（ploidy）、DNA指数（DNA Index DI）和细胞群体中进行DNA合成的增殖细胞的百分比（S-phase fraction，SPF）。DNA倍体是细胞核中重要遗传物质DNA含量的一个客观指标，肿瘤细胞的无限制分裂、增殖与细胞核中DNA含量变化密切相关。DNA倍体是组织细胞的基本生物学特性之一。肿瘤细胞DNA倍体变化不仅对肿瘤发生发展有重要理论意义，而且对肿瘤的诊断、鉴别诊断、肿瘤转移、肿瘤治疗和预后判断也有一定的临床意义[2]。S期指数是一项检测DNA合成的增殖细胞百分比的指标，能较准确地计算处于增殖期的细胞比例，而肿瘤增殖强弱能体现其侵袭性。 　　1.研究对象：回顾性分析2010年1月～2013年1月郑州人民医院乳腺外科收治的乳腺癌病例，组织来源新鲜乳腺癌癌组织，在临床工作中快速冰冻病理确诊的乳腺癌，留取的癌灶组织；入选的乳腺癌病例，均为女性，全组135例乳腺癌，LumunalA型占52.6%（71/135），Luminal B型占24.4%（33/135），HER-2过表达型占8.9%（12/135），三阴性型占14.1%（19/135），大于等于50岁有52例，小于50岁有83例，平均年龄47.6岁，中位年龄48岁；按1997年UICC TNM分期，III期21例，II期94例，I期20例；肿瘤≤2cm 21例，2cm5cm 22例，淋巴结转移66例，无淋巴结转移69例。 　　2.研究方法 　　2.1 主要试剂 　　美国BD公司Ccycle TESTTMPLVS DNA Rent Kit试剂盒，磷酸缓冲液（PBS），A液（trysin buffer），B液（trysin inhibitor and RNase buffer），C液（propidium iodide stain solution）。 　　2.2 检测方法 　　2.2.1 单细胞悬液样品的制备 　　将新鲜病灶组织50-100mg剪碎或蜡块组织去蜡后剪碎，同时用PH值为7.4的磷酸缓冲液（PBS）缓滴，用300目滤膜过滤，得到的单细胞倒入试管内离心（1000转/分，5分钟）；弃去上清液后，待检。 　　2.2.2 DNA含量及倍体检测的样品制备 　　应用BD公司Ccycle TESTTMPLVS DNA Rent Kit试剂盒，PI染色法制备样本；①在每个细胞悬液试管中加入250μl