β-淀粉样蛋白和T淋巴细胞相互作用对神经元再生影响的初步研究-人体解剖与组织胚胎学专业论文.docxVIP

广东药学院硕士研究生学位论文 广东药学院硕士研究生学位论文 I I β- 淀粉样蛋白和 T 淋巴细胞相互作用 对神经元再生影响的初步研究 研究生 郑嵋戈 导 师 李国营教授 摘 要 研究背景： 阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease, AD)是一种最为常见的中枢神经系统退行性疾 病，为痴呆的最主要类型。目前 “Aβ 假说”被广泛地接受为 AD 最主要的发病机理， 即老年斑的主要组成成分——β-淀粉样蛋白(amyloid-β, Aβ)是 AD 发病进程的中心机 制，其在特定脑区内聚集，引发相应的神经毒性作用，造成突触损伤，神经元死亡， 从而导致了 AD 患者记忆衰退和认知功能障碍等相应症状的产生。Aβ 的神经毒性能 造成神经元死亡，但其对神经元再生的影响目前还不清楚。 最近研究发现，中枢神经系统特异性的 T 淋巴细胞(CNS-specific T lymphocytes) 在维持成体神经元再生和空间学习记忆能力中起重要作用。很多研究也表明 T 淋巴细 胞参与 AD 的病理过程，并且其在 AD 脑内的数目明显增加，但迁移入脑的 T 细胞 (infiltrating T lymphocytes)在 AD 中的作用目前仍不清楚。 为进一步研究和证实在 AD 发生中 Aβ 和 T 淋巴细胞的作用，本课题拟从神经元 再生的角度入手，提出如下假说：(1)AD 中，Aβ 不仅能诱导神经元的死亡，还能抑制 神经元的再生，从而造成脑内神经元大量丢失和供给不足，最终导致 AD 的发生；(2)Aβ 抑制神经元再生的毒性效应可能与抑制 T 淋巴细胞的促神经元再生作用有关，如抑制 其关键效应因子的表达；(3)T 淋巴细胞能促进 Aβ 的清除，改善脑内神经发生区域的 内环境，维持神经元的再生，从而延缓 AD 病情。为证实本课题提出的假设，为 AD 研究提供新的思路和方法，课题设计如下： II II 研究方法： 1. 利用 Aβ-intrahippocampal injection 的方法，向实验小鼠脑内海马部位注射寡聚态 Aβ1-42，使其在脑内沉积，以模拟 AD 的主要病理特征，制备动物模型。分野生 型组(BALB/c-WT)和 T 淋巴细胞缺陷型组(BALB/c-nude)，实验组注射寡聚态 Aβ1-42(每只小鼠每侧海马注射 4μg/2μl)，对照组注射等体积无菌生理盐水(NS)。 分术后第 7 天、14 天和 21 天三个时间点取材。 2. 常规 HE 染色，比较 Aβ1-42 组和 NS 组之间的差异。 3. 利用 Brdu 和 DCX 双重标记，检测各组海马内神经元的再生情况。 4. 利用免疫组织化学方法检测各实验组脑内 Aβ1-42 的沉积，比较 WT 组和 nude 组 在各时间点小鼠脑内 Aβ1-42 沉积量的变化。 5. 利用 Western blot 检测 IFN-γ、NF-κB 在各组海马内的表达。 研究结果： 1. 与 NS 对照组相比， Aβ1-42 实验组注射后的炎症损伤区域明显扩大， Aβ1-42-injection 引发神经元变性。 2. BrdU 标记显示，Aβ1-42-injection 组和 NS-injection 组小鼠脑内海马齿状回的亚颗 粒细胞层(SGZ)和注射创伤部位均有新生细胞产生。BrdU/DCX 双标显示，阳性细 胞即新生的神经元主要集中在海马齿状回的亚颗粒细胞层；与 NS-injection 组相 比，Aβ1-42-injection 组双标阳性细胞明显减少，差异极显著(P0.01)；BALB/c-WT 组明显多于 BALB/c-nude 组，有极显著性差异(P0.01)。 3. 实验组中 Aβ1-42 阳性斑块主要沉积于海马结构和皮质区。在 BALB/c-WT 小鼠脑 内，Aβ1-42 的沉积，随时间的推移——由术后第 7 天至第 21 天，逐渐减少。而 在 BALB/c-nude 小鼠脑内，Aβ1-42 沉积在三个时间点的变化并不显著。尤其是在 术后第三个时间检测点，两组差异尤为明显，BALB/c-WT 组小鼠脑内 Aβ1-42 的 残余比 BALB/c-nude 组明显减少。 4. Western blot 检测显示，效应因子 INF-γ 和 NF-κB 在 BALB/c-WT 组小鼠海马内有 阳性表达，而在 BALB/c-nude 组中含量低于检出水平或是不表达。在 BALB/c-WT 小鼠中，与 NS-injection 组相比，Aβ1-42-injection 组 INF-γ、NF-κB 的表达明显减 少，差异极显著(P0.01)。 III III 结论： 1. Aβ1-42 能显著抑制神经元的再生，这种毒性效应可能与海马内 INF-γ、NF-κB 的 表达下调有关