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维普资讯 一 工 }2-。s3) 第 9卷 第3期 中 国 病 毒 学 、 ．9 No．3 1994年 9月 VIROLOGK Al SINICA Sep． 1994 植物组织粗汁液中的番木瓜环斑病毒的ELISA检测技术’ ●H———，墨一．—堇一：啦 (辅农业大学植物病毒研究室，广州510642) 孕34} 提要 率研究建立和改进了检测番术瓜和西葫芦组织粗汁液里的番术瓜环斑病毒(PRV)的DAC- ELISA法和Dot-ELISA法。用不同的ELISA方法来检测不同寄主植物粗汁液里的PRV，其所用的合 适的制备粗汁液的缓冲液是不同的．用DAC-ELISA法检测西葫芦粗汁液时 ， 0．6mol／L磷酸盐缓 冲液 (pH7．5，内古0．1mol／L乙二胺四乙酸二钠)为宜t而检测番术瓜粗汁液时，则还要加入0．25 mol,／L脲．用Dot-ELISA法检测时，在上述磷酸盐缓冲液中加入2 聚乙烯呲咯烷铜能提高对西葫 芦蛆汁液的检测效果．应用合适的涮各粗汁液的缓冲渣，DAC-ELISA法和Dot—ELLSA法的灵被度分 别提高刊 I／4096和 1／1024(稀释度)。本研究还表明，影响D^0E璐 A法的定量蔼I定的主要因素是 粗汁液的稀释度和包被液(阻05mol／L碳酸盐缓冲液，pH9．B)的用量。在较高粗汁液稀释度和包被 L．)的一种重要病害。目前多种酶联免疫吸附测定法(ELISA)已用以检测植物病毒 ，其中以双 抗体夹心法 (Doubl~Antibodyq,~anciwi~h，DAS—ELISA法 ，简称DAs-法)[1]州接ELLSA法中的抗原 直接包被 (DirectAntigenCoating，DAC-ELISA法 ，简称 DAC一法)[20]和斑点免疫 吸附测 定法 (Dot—ELISA，简称Dot-法)[I]应用得最为广泛。但DAS-法一般认为在检测植物病毒时具有较强 的株系专化性 [5朋；DAC，法则没有这个现象，可用于检测相关病毒株系 ]，而且其灵敏度高于 DAS一法ls．0；Dot一法也可用以检测相关病毒株系 ，并且还具有简单 、快速和经济的特点 。 在 PRV的检测方面 ，Gonsa,Iyes和 Ishii(1980)r报道了DAS一法 ，陈枝楠 l993)C“：则建立 了Dot，法，但在检测感病植物组织粗汁液中的PRV方面却未进行深入研究。而用DAC一法检测 PRV来见有研究报道 。因此 ，本研究应用DAC-法和 DOt一法在检测感病植物组织粗汁液 中的 PRV上进行了较深入的工作。 材料与方法 l 抗原材料 感染了PRV黄点株系(PRVvs)的番术瓜和西葫芦病叶采 自温室．取0．2克病叶置于2九ll的 制 各缓冲液中，研磨后用 10000r／m离心 10分钟 ，其上清液即为检测用的病叶枇汁液，对照为同法翩各的健康叶 粗汁液 PRV 的提纯按Goosalves和 Ishii0叼的方法盎行． 本文于 1993年 7月 lg日收 ，10月 6日 固 ·农业部博士点基盘项 目 维普资讯 25O 中 国 病 毒 学 第 9卷 2 抗血清 兔抗 PRV~s血清由本研究室提供 ，工作浓度为 1／800。 3 酶结合物 辣根过氧化物酶标记A蛋白(SPA-HRP)购于上诲荣盛生物试剂厂，工作浓度为 1／40． 4 DAC-法 车研究建立的DA0法是接Hvt~as等(1987)[t1方法加以修改后制订的。具体方法是：(”所检样品 用 0．05oto!，L碳酸盐缓冲液(简称cB，pH9，6)稀释、注入聚乙烯多孔反应扳，每孔 200~1I(2)每孔