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应用RT―PCR方法检测牛轮状病毒研究 　　摘 要：牛轮状病毒主要引起犊牛腹泻，近年来，其国内感染率不断增加，本研究参照牛轮状病毒VP7基因序列，设计合成特异性检测引物，通过RT-PCR反应条件的优化，建立了检测牛轮状病毒的一步法RT-PCR方法，并应用该方法进行了临床样品的检测。结果显示，该方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性。本研究为牛轮状病毒的检测提供了一种敏感、特异、快速、简单的方法，具有很好的临床应用价值，值得推广应用。 　　关键词：牛轮状病毒；RT-PCR；检测 　　Abstract： bovine rotavirus causes diarrhea in calves， in recent years， the infection rate is increasing， this study refers to the bovine rotavirus VP7 gene sequence， design and synthesis of specific primers， through the optimization of RT-PCR reaction conditions， established a one-step RT-PCR method for detection of bovine rotavirus， and application of the method for detection of clinical samples. The results showed that， the method has good specificity， sensitivity， reproducibility and clinical application. It provides a method for sensitive， specific， rapid， simple method for the detection of bovine rotavirus， which had good clinical application value， and its worthy of popularization and application. 　　Keywords： bovine rotavirus； RT-PCR； detection 　　牛轮状病毒（bovine rotavirus，BRV）又称犊牛腹泻病毒（calfdiarrha virus），属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus），是引起犊牛急性腹泻的主要病原之一，呈全世界范围内流行，给全球养牛业带来巨大的经济损失[1，2]。BRV主要感染1～7日龄的犊牛，可引起犊牛消化道机能紊乱，临床上以精神沉郁、食欲废绝、呕吐、水样腹泻、严重脱水和酸中毒等为主要特征，严重的可以导致死亡，病死率高达50%，成年牛多呈隐性感染[3，4]，BRV感染后易继发细菌性感染，可使病情进一步恶化[5]。近年来，国内BRV感染的阳性率不断增加，对我国养牛业的健康发展造成了严重的影响和巨大的威胁[6]。RT-PCR技术操作简单、检测快速、敏感性高、特异性强，是目前动物疫病常用的分子生物学诊断技术，应用RT-PCR方法检测BRV，有助于对临床表现腹泻症状的病牛进行快速确诊，也有利于疾病的早期诊断和流行病学调查，为疾病的诊断提供更敏感、特异的方法。 　　1 材料和方法 　　1.1 病毒 　　牛轮状病毒（bovine rotavirus，BRV）、牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛冠状病毒（bovine coronavirus，BCV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）均由枣庄职业学院动物疫病检验检疫中心实验室保存。 　　1.2试剂、载体及试剂盒 　　Trizol试剂购自天根生化科技（北京）有限公司；鼠源M-MLV反转录酶、Ribonuclease Inhibitor 购自生工生物工程（上海）股份有限公司。Ex Taq酶、dNTP为TaKaRa公司产品；病毒基因组RNA提取试剂盒、病毒基因组DNA提取试剂盒购自百泰克科技（北京）有限公司。 　　1.3 病料处理 　　牛场送检的腹泻病料，用无菌研钵研磨并用PBS液（pH 7.2-7.4）5倍稀释，分装1.5 mL灭菌EP管，反复冻融3次，12 000 r/min离心5 min，取上清待用。 　　1.4病毒基因组RNA/DNA的提取 　　按病毒基因组RNA提取试剂盒分别提取牛轮状病毒（BRV