左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病小鼠足细胞nephrin与podocin表达影响.docVIP

左归降糖益肾方对2型糖尿病肾病小鼠足细胞nephrin与podocin表达影响 　　摘要：目的 观察左归降糖益肾方对MKR转基因2型糖尿病肾病（DN）小鼠足细胞nephrin、podocin表达的影响，探讨其作用机制。方法 8周龄MKR小鼠40只随机分为4组，空白组（A组）、DN组（B组）、DN+中药组（C组）、DN+糖适平+贝那普利组（D组）。B、C、D组给予高脂饮食联合右侧肾切除造模。手术4周后，各给药组给予相应药物，4周后处死小鼠。电化学法观察小鼠空腹血糖，全自动生化仪检测血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）， ELISA法测定尿微量白蛋白（UmAlb），RT-PCR法检测nephrin、podocin mRNA表达，Western Blotting法测定nephrin、podocin蛋白表达，电镜观测足细胞形态结构。结果 与A组比较，B组小鼠空腹血糖、SCr、BUN及UmAlb均明显升高（P0.01），肾小球足细胞nephrin、podocin mRNA及蛋白表达明显下调（P0.01）。给药后，与B组比较，用药组小鼠血糖、SCr、BUN及UmAlb明显下降（P0.01），肾小球足细胞nephrin、podocin mRNA及蛋白表达明显上调（P0.01，P0.05）。电镜结果显示，给药组小鼠肾小球足细胞较B组明显改善。结论 左归降糖益肾方通过恢复2型糖尿病肾病小鼠足细胞nephrin和podocin的表达而保护肾脏。 　　关键词：糖尿病肾病；左归降糖益肾方；足细胞；nephrin；podocin；MKR小鼠 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.03.016 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）03-0053-05 　　糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，肾小球足细胞是DN发生发展的关键细胞，nephrin、podocin作为足细胞裂孔隔膜的主要成分，维持着足细胞的正常形态和功能，其基因和（或）蛋白表达的异常在蛋白尿的发生机制中有着相当重要的作用。左归降糖益肾方由明代医家张景岳的左归丸化裁而来，具有滋阴益气、解毒活血之功效。本课题组前期研究发现，左归降糖益肾方可能通过降低空腹血糖，改善糖耐量、抑制炎症因子的产生和氧化应激作用，解除高血糖对肾小球的刺激，阻断炎症诱导的损伤而达到减少蛋白尿、改善糖尿病早期肾脏损伤的目的[1]。本实验在前期研究的基础上，以高脂喂养并行单侧肾切除的MKR糖尿病肾病小鼠为研究对象，观察左归降糖益肾方对DN小鼠足细胞结构及功能的影响，并探讨其部分机制，为该方进一步应用于临床提供实验依据。 　　1 实验材料 　　1.1 动物 　　MKR转基因2型糖尿病小鼠（骨骼肌特异性Insulin/IGF-1双受体缺失的转基因小鼠），美国国立卫生研究院糖尿病研究中心Dr.D.LeRoith提供。MKR小鼠（纯合子），经自然交配繁殖后用于实验观察。MKR鼠饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，饲养笼具、垫料、饲料、饮水均按SPF级实验动物的要求进行制备与消毒。 　　1.2 药物与饲料 　　左归降糖益肾方由熟地黄、山萸肉、黄芪、丹参等药物组成，原药材购自湖南中医药大学第一附属医院药房，经鉴定为正品，药物经水煎2次，合并煎液，浓缩为1.25 g原药材/mL，经灭菌后置于冰箱4 ℃保存备用。糖适平，30 g/片，北京双鹤药业有限责任公司生产，批号1120337；贝那普利，5 mg/片，深圳信立泰药业股份有限公司生产，批高脂饲料由普通饲料加猪油15%、胆固醇1%组成。 　　1.3 主要试剂 　　末端全血葡萄糖试剂条（美国强生公司，批号342089）；尿微量白蛋白酶联免疫法（ELISA）试剂盒（ADL公司，lot：201302）；总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，批号K9802）；RT-PCR试剂盒（Fermentas公司，批号K1621）；引物合成（上海生工生物工程技术服务有限公司）；通用型SABC试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号12122A10），DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号K13522E），nephrin、podocin鼠抗兔单克隆抗体（博奥森生物技术有限公司）。 　　1.4 主要仪器 　　强生稳豪倍易血糖测试仪（美国强生公司），奥地利产酶标仪，日产HT7700型透射电镜，日立7150全自动生化分析仪（日本），SANYO-80 ℃冰箱，Leica石蜡切片机，Bio-Rad mini型垂直电泳仪及半干转膜系统，Ultrospec 4300紫外可见光分光度计。 　　2 实验方法 　　2.1 造模、分组与给药 　　选取8周龄经遗