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左归降糖益肾方对MKR糖尿病肾病小鼠足细胞葡萄糖调节蛋白78CEBP同源蛋白表达影响 　　摘要：目的 观察内质网应激相关分子葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）在MKR转基因糖尿病肾病（DN）小鼠足细胞的特异性表达及左归降糖益肾方的干预作用。方法 以8周龄MKR小鼠为研究对象，随机分为空白组、模型组、左归降糖益肾方组、4-苯基丁酸组、格列喹酮片+贝那普利组，以C57野生鼠为正常组，每组10只。采用高脂喂养加单肾切除复制DN模型，各给药组予相应药物灌胃30 d。采用电化学法观察小鼠空腹血糖（FBG），ELISA测定尿微量白蛋白（UmAlb），RT-PCR及Western blot检测GRP78、CHOP基因和蛋白表达，电镜观察足细胞形态结构。结果 与空白组比较，模型组FBG、UmAlb明显升高（P0.01），足细胞GRP78基因及蛋白表达明显下调（P0.01），CHOP基因及蛋白表达明显上调（P0.01）；与模型组比较，各给药组FBG、UmAlb明显降低（P0.01），左归降糖益肾方组、4-苯基丁酸组GRP78 基因及蛋白表达明显上调、CHOP基因及蛋白表达明显下调（P0.01）。电镜观察结果显示，各给药组小鼠肾小球足细胞结构、数量及密度较模型组明显改善。结论 左归降糖益肾方能改善内质网应激介导的足细胞损伤，延缓DN进展。 　　关键词：糖尿病肾病；左归降糖益肾方；MKR小鼠；内质网应激；足细胞；葡萄糖调节蛋白78；C/EBP同源蛋白 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.03.017 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）03-0065-04 　　糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最严重的微血管并发症之一，其发生发展与糖代谢紊乱、肾脏血流动力学改变、细胞因子异常表达、遗传基因易感性等诸多因素有关。近年来研究提示内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）介导的足细胞损伤在导致DN蛋白尿及肾小球硬化方面起着重要作用，而针对ERS的药物研究也成为热点。目前已发现化学分子伴侣4-苯基丁酸通过调控ERS强度，抑制肾皮质的氧化应激和炎症激活，抑制ERS介导的细胞凋亡[1]，并通过缓解胰岛素抵抗，降低血糖[2]，影响DN进展。左归降糖益肾方由左归丸化裁而来，具有滋阴益气、活血解毒之效。前期研究已明确其降低血糖、改善糖耐量、抑制炎症因子和氧化应激作用[3]，并具有维持足细胞结构相关蛋白nephrin、podocin表达，保护足细胞、减少蛋白尿、改善糖尿病早期肾脏损伤的作用[4]。而该方对足细胞的保护机制仍不十分明确。本实验观察ERS相关分子葡萄糖调节蛋白78 （GRP78）、C/EBP同源蛋白（CHOP）在MKR转基因DN小鼠足细胞的特异性表达及左归降糖益肾方的干预作用，为DN的临床治疗提供实验依据。 　　1 实验材料 　　1.1 动物 　　MKR小鼠为骨骼肌特异性Insulin/IGF-1双受体缺失的转基因2型糖尿病小鼠，美国国立卫生研究院糖尿病研究中心Dr.D.LeRoith提供，饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，许可证号SYXK（湘） 2009-0001，经自然交配繁殖；C57野生鼠，湖南中医药大学刘伯炎老师惠赠，许可证号SYXK（湘）2013-0005。 　　1.2 药物与饲料 　　左归降糖益肾方（熟地黄18 g、山萸肉12 g、黄芪18 g、丹参9 g、牛膝9 g等9味），购自湖南中医药大学第一附属医院药房。水煎2次，混合后浓缩成为2 g原药材/mL药液，经灭菌后4 ℃保存备用。4-PBA（德国进口，lot：STBB 6241V）用蒸馏水37 ℃溶解，制成浓度为0.5 g/mL溶液。格列喹酮片（30 mg/片，北京双鹤药业有限责任公司，批号1120337）和贝那普利片（5 mg/片，深圳信立泰药业股份有限公司，批按3∶1比例用蒸馏水制成浓度分别为0.79、0.26 mg/mL的混合药液。高脂饲料由普通饲料加15%猪油、1%胆固醇组成，由湖南中医药大学SPF级实验动物中心加工制成。 　　1.3 主要仪器与试剂 　　Thermo高速冷冻离心机；BioTek酶标仪；日产HT7700 型透射电镜；日立7150全自动生化分析仪（日本）；Thermo -80 ℃冰箱，Leica石蜡切片机；北京六一牌垂直电泳仪及转膜系统；Eppendorf核酸蛋白分析仪。尿微量白蛋白酶联免疫检测试剂盒（上海同田生物技术有限公司，批；Simply P总RNA提取试剂盒（BioFlux，lo；HiF