03-2 基因工程制药.pdfVIP

生物技术制药 3 基因工程制药 3.1.4 基因工程菌发酵培养与控制  工程菌的培养特点  工程菌的大规模培养  终点控制  生产安全 3.1.4.1 基因工程菌的培养特点 对菌体生长的调控主要有两种观点： •能量的供应决定了菌体的最大比生长速率； •小分子前体和催化组分等等的限制决定了菌体的 最大比生长速率。 一、菌体生长与能量的关系 当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提 供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。高 浓度的乙酸能明显抑制菌体的生长。 解决方法：选用不同的碳源、控制补料速度、连 续培养中控制稀释速率等培养方法，都能在一定范 围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生。 实质：控制菌体的糖酵解速度，避免乙酰辅酶A 的 积累和乙酸的产生，以降低供能速度或前体供应速 度来降低蛋白合成和菌体生长速度。 二、菌体生长与前体供应的关系 细胞竞争共同的前体和催化结构，使在同样的 培养基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细 胞，特别是工程菌诱导后，由于外源基因的大量表 达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。 3.1.4.2 基因工程菌的大规模培养 工程菌的培养控制  质粒稳定性  重组质粒拷贝数的控制及表达效率 基因工程菌的培养过程主要包括： （1 ）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件， 如温度、pH 、培养基各种组分以及碳氮比，分 析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响； （2 ）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案 以及顺序。 生产特点 工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验室 规模低。 应提高重组DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表达 产物向细胞外分泌。 工程菌的原宿主通常是某些培养物质(如某种氨基 酸或维生素等) 的缺陷型，有些基因工程细胞生产过 程亦产生一些抑制细胞生长的代谢物。 培养方式 基因工程细胞的培养过程与一般需氧细胞培养 基本一致，培养方式亦无差异，可采用分批培养方 式，亦可采用连续培养、半连续培养及透析培养等 方式。 高密度发酵补料调控 重组大肠杆菌高密度发酵成败的关键是补料和 诱导策略。合理流加使葡萄糖保持在一定的水平可 降低葡萄糖效应。 恒速流加:比生长速率降低,菌体量线性上升。 变速流加:在菌体密度高时，通过加入更多的营养物 质促进细胞生长并对表达有利。 指数流加补料:补料速度呈指数上升, 比生长速率恒 定 ,可控制基质浓度在较低的水平,减少乙酸生成, 应用较广。 一、工程菌的培养控制 1 底物浓度的控制 基因工程菌培养至少要遵循P1级物理防护的规 定，必需进行菌体的高密度培养。 基因工程菌通常是维生素或氨基酸的营养缺陷 型突变株。维生素可在培养开始即加入，氨基酸可 在调节pH值同时补加氨基酸混合物和葡萄糖的方法。 培养基组成与控制 (1) 碳源 大肠杆菌：蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源。 酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。 添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等， 对菌体生长具有一定的促进作用。 例：胡志明等利用M9复合培养基, 以甘油为碳源进行 连续流加，使重组人血管内皮细胞生长因子表达 量达到23 %。 K leman GL 等的研究表明，重组大肠杆菌 W3100 在葡萄糖浓度为0.5g/L ，pH6.0 的培养基中, 乙酸6g/L ，而pH7.5 时为12g/L。 (2) 氮源 直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用硝态 氮。几乎都能利用有机氮源。 不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很高 的选择性。 大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。 酵母：利用氨基酸为氮源。 (3) 无机盐 磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、 铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态。 (4) 选择剂  维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。  根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因，添加 缺陷选择剂。 选择剂种类 营养缺陷互补和抗生素抗