胰岛素通过Erk通路促进人乳腺癌细胞MCF―7增殖和迁移.docVIP

胰岛素通过Erk通路促进人乳腺癌细胞MCF―7增殖和迁移 　　[摘要]目的观察胰岛素对人乳腺癌细胞MCF-7中Erk信号通路的影响及其对MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法分别采用0、50、100和200nM不同剂量的胰岛素处理MCF7细胞0、24、48和72h，采用Western blot方法检测MCF-7细胞中Erk信号通路的磷酸化活化情况，采用MTT方法检测MCF-7细胞的增殖情况。通过伤口愈合实验和Boyden小室检测200nM胰岛素处理72h对MCF-7细胞侵袭和迁移能力的影响。采用Erk信号通路抑制剂预处理MCF-7细胞，观察Erk信号通路在胰岛素促MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭能力中的作用。结果同0nM胰岛素处理组相比，不同剂量的胰岛素均可显著上调Erk的磷酸化水平，加强MCF-7细胞的增殖能力（P0.05），且这种作用具有计量依赖性。同对照组相比，200nM胰岛素处理72h后，MCF-7细胞侵袭和迁移能力均显著增强（f=188.000、95.640，P0.05）。采用Erk信?通路阻断剂U0126阻断MCF-7细胞中的Erk信号通路后，胰岛素促MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭的能力显著降低（P0.05）。结论胰岛素可通过激活MCF-7细胞中的Erk信号通路，增强肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。 　　[关键词]胰岛素；乳腺癌；MCF-7；增殖；迁移 　　[中图分类号]R737.9 　　[文献标识码]B 　　[文章编号]2095-0616（2016）23-33-06 　　胰岛素可与胰岛素样生长因子-1受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）和胰岛素受体（insulin receptor，IR）及向下游传递活化信号，进而促进细胞的有丝分裂，胰岛素的这一作用促使研究者们猜想其与肿瘤的发生发展是密不可分的。研究结果证实，高胰岛素血症、2型糖尿病以及肥胖等代谢相关性疾病可导致肿瘤的发病风险显著升高。目前女性乳腺癌的发病率已成为女性恶性肿瘤中发病率最高的一种，而胰岛素作为一种生长因子，其在女性乳腺癌发病中的作用也得到相关文献的证实。而目前关于胰岛素参与乳腺癌发生发展中的机制研究仍需要更深层次地探索。据此，本研究期待通过观察胰岛素对人乳腺癌细胞MCF-7中Erk信号通路活化情况的影响及其对MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移的影响，初步探讨胰岛素参与乳腺癌发生发展的机制。结果如下。 　　1.材料与方法 　　1.1细胞及试剂 　　首先由取中国医学科学院基础医学研究所提供的人乳腺癌细胞株MCF7，然后采用DMEM培养基（含胎牛血清，浓度为10%）对其进行培养。一抗为鼠抗人p-Erk抗体，由深圳晶美生物科技有限公司提供；羊抗兔和羊抗鼠IgG（由辣根过氧化物酶标记）均购自Bio-Rad公司；Erk信号通路抑制剂、蛋白酶、CytoBuster蛋白、磷酸酶抑制剂购自Thermo公司；Boyden小室（用作侵袭实验）购自美国Millipore公司。 　　1.2研究方法 　　1.2.1细胞处理方法分别采用不同浓度的胰岛素对受试细胞分别处理0、24、48和72h，其中胰岛素浓度分别为0、50、100和200nM。 　　1.2.2细胞总蛋白提取首先利用冰PBS对待检细胞连续两次洗涤，然后实施离心分离处理，离心加速度和时间分别设置为400×g、5min；处理完成后在沉淀中依次加入蛋白酶、磷酸酶抑制剂，然后加入CytoBuster蛋白，剂量为100uL，将所得实际混合均匀后于25℃条件下孵育处理15min；再次行离心分离处理，离心加速度和时间分别设置为12000×g、15min，温度为4°C。取上清液对蛋白浓度进行检测，另取部分上清液分装15uL，保存于-80℃恒温冰箱中。 　　1.2.3蛋白浓度测定首先采用BCA法测定：对标准品进行稀释处理，并按照50：1的体积比混合完成工作液的配置，在96孔板中分别加入200uL的标准工作液，并加入25uL待测样品或者标准品，每个待测标本均需要设置3个复孔。在37°C的条件下完成时长为30min的孵育处理，测定OD值后根据标准品所得结果绘制标准曲线图，并据此推算出待测样品的水平。采用Western blot测定：将提取的蛋白经SDS（浓度为8%-10%）和浓缩胶（浓度为5%）进行分离处理，待样品半干后需要将其转印到硝酸纤维素膜，并加入BSA（浓度为5%）进行时长为2h的封闭孵育，加入一抗后在4℃条件下孵育，时长为12h。次日采用TBST（浓度为0.1%）的溶液对膜片反复3次冲洗，每次冲洗时长均为5min。在待测样品中添加相应标记二二抗，25℃条件下进行时长为1h的封闭孵育。完成后采用TBST（浓度为0.1%）的溶液冲洗膜片，并利用深