重组人粒细胞集落刺激因子的peg修饰 纯化及药理学分析-purification and pharmacological analysis of recombinant human granulocyte colony stimulating factor modified by peg.docxVIP

I I 缩略词表 缩略词表 英文缩写 英文全名 中文全名 G-CSF PEG TRIS SDS TEMED PAGE HPLC Fig. MTT CPA Gln PBS EDTA OD ELISA Granulocy Colony-Stimulating Factor Polythylene Glycol Trihydroxymethlaminmethane Sodium dodecyl sulfate N,N,N’,N’-tetra methylethylene diamine Polyacrylamide gel electrophoresis High performance liquid chromatograpy Figure 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide Cyclophosphamide Glutamine Phosphate-buffered saline Ethylene diaminetetra acetic acid Optical density Enzyme-linked immunosorbent assay 粒细胞集落刺激因子 聚乙二醇 三羟甲基氨基甲烷 十二烷基硫酸钠 N,N,N’,N’-四甲基乙二胺 聚丙烯酰胺凝胶电泳 高效液相色谱 图 3-4, 5-二甲基噻唑-2, 5- 二酚四唑溴化物 环磷酰胺 谷氨酰胺 磷酸盐缓冲液 乙二胺四乙酸 光密度 酶联免疫吸附测定 BSA OPD Bovine serum albumin O-phenylenediamine 牛血清白蛋白 联苯二胺 HRP Horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 II II 重组人粒细胞集落刺激因子的 PEG 修饰、纯化及药理学研究 摘要 目的：通过重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）的 PEG 修饰、分离纯化获得 单修饰的 PEG-rhG-CSF,并进行药理学研究。方法：用单甲氧基聚乙二醇活性酯 （mPEG20k-NHS）对 rhG-CSF 进行化学修饰，经分离纯化获得 PEG20K-rhG-CSF 偶联物；利用 NFS60/MTT 法对 PEG-rhG-CSF 进行体外测活；正常小鼠分别单次皮 下注射高、中、低三个浓度 PEG-rhG-CSF，比较各组之间药效学的差异；环磷酰 胺所致外周血白细胞降低的模型小鼠分别单次皮下注射高、中、低三个浓度 PEG-rhG-CSF 和多次注射 rhG-CSF，比较 PEG-rhG-CSF 各组内及与 rhG-CSF 组间 的药效学差异；用 NFS60/MTT 法和双抗体夹心 ELISA 法分别测定单次静脉注射 PEG-rhG-CSF 和 rhG-CSF 的血药浓度，分别比较两组之间药代动力学的差异。结 果：获得了纯度超过 97％的 rhG-CSF 的 PEG 单修饰产物；NFS60/MTT 法体外测 活表明 PEG-rhG-CSF 的体外活性与 rhG-CSF 相比有所下降；而在正常小鼠和病理 模型小鼠的体内药效学研究表明 PEG-rhG-CSF 各组间具较明显的量效关系且一 次注射 PEG-rhG-CSF 与多次注射 rhG-CSF 的药效作用相当；在小鼠体内药动学研 究中，NFS60/MTT 法测得的单次 ivPEG-rhG-CSF 和 rhG-CSF 的 T1/2 分别为 13.17 ±1.32 h、1.98±0.25h,AUC 分别为 47825.65±2135.62ng·h/ml、5000.57± 256.33ng·h/ml,CL 分别为 0.000021±2.98E-06L/h·kg、0.00020±3.25E-05L/h·kg; 双抗体夹心 ELISA 法测得的单次 ivPEG-rhG-CSF 和 rhG-CSF 的 T1/2 分别为 13.88 ±1.36 h、2.17±0.33h, AUC 分别为 53894.27±2327.83ng·h/ml、5709.73± 275.19ng·h/ml, CL 分别为 0.000019 ± 2.98E-06L/h·kg 、 0.00018 ± 3.25E-05 L/h·kg;结果表明 PEG-rhG-CSF 在小鼠体内的半衰期显著延长，为 rhG-CSF 的 6 倍多，而两种方法测得的半衰期接近，表明可以用双抗体夹心 ELISA 法代替 NFS60/MTT 法来测量 PEG-rhG-CSF 在动物血液中的药物浓度。结论：对纯化的 rhG-CSF 的 PEG 单修饰产物进行了药效学和药代动力学研究，表明 PEG-rhG-CSF 在动物体内的作用时间明显延长，药效作用显著增强，为研制具有长效作用的 PEG-