主动脉瓣退行性钙化机制及调控的实验分析-experimental analysis on mechanism and regulation of degenerative calcification of aortic valve.docxVIP

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 2 PAGE 2 中文摘要 主动脉瓣退行性钙化机制及调控的实验研究 博士研究生：陈 思 导师： 董念国 教授 第一部分 主动脉瓣间质细胞和内皮细胞体外分离与培养 目的 体外分离和培养瓣膜间质细胞和内皮细胞，总结一种方便、快捷、重复性高的 瓣膜细胞分离培养方法。 方法 采用胶原酶消化法从猪主动脉瓣中分离并体外扩增瓣膜间质细胞和内皮细胞。 光学相差显微镜每日观察细胞形态。生长良好的 2-3 代细胞传入培养板，每日计算细 胞个数绘制生长曲线。免疫荧光染色行细胞表型鉴定，激光扫描共聚焦显微镜观察并 拍照。 结果 胶原酶消化法可成功从猪主动脉瓣中分离出间质细胞和内皮细胞，1-2 周即可获 得排列紧密的细胞单层。间质细胞生长排列呈放射状或漩涡状走行，并可互相重叠生 长。内皮细胞紧密排列似典型鹅卵石或铺路石样分布。细胞生长曲线示间质细胞生长 活跃期为传代后 3-5 天，内皮细胞为第 4-5 天。表型鉴定提示瓣膜间质细胞 α- 平滑 肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）和波形蛋白（vimentin）免疫荧光 染色阳性，瓣膜内皮细胞血管性假血友病因子（Von Willebrand factor，vWF）和血小板 内皮细胞粘附分子（Platelet-endothelial cell adhesion molecule，PECAM）染色阳性。 结论 本研究探索的瓣膜间质细胞和内皮细胞分离培养方法简便、易行、重复性高， 是一种理想的瓣膜细胞培养方法。 关键词 主动脉瓣 间质细胞 内皮细胞 胶原酶 细胞培养 第二部分 体外诱导主动脉瓣间质细胞钙化模型的建立 目的 建立体外瓣膜细胞钙化模型，诱导主动脉瓣间质细胞钙化，并观察钙化间质细 胞表型变化。 方法 取传代 4-8 代间质细胞，随机分为 2 组，实验组以含 β-甘油磷酸、维生素 C、 地塞米松的钙化培养基进行钙化诱导培养，对照组以标准培养基培养，培养 2 周。显 微镜镜下行钙化结节计数，茜素红染色观察并半定量检测钙沉积，检测碱性磷酸酶活 性，实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real Time RT-PCR）检测间质细胞 α-SMA 及钙化相关因子（骨钙素, 骨桥蛋白，核心结合因子 α1 Cbfa1）基因表达。 结果 间质细胞经钙化诱导培养 2 周可成功诱导钙化，实验组中间质细胞可自发形成 钙化结节，数量显著高于对照组(156.25±17.38/孔 VS 2.5±1.29/孔，P0.05)，钙沉积 检测实验组显著高于对照组(17.52±2.04 VS 1±0.22，P0.05); 钙化诱导组碱性磷酸酶 活性较对照组明显升高，2 周时活性是对照组的 2.3 倍（P0.01）。Real Time RT-PCR 提示，实验组 α-SMA、骨钙素、骨桥蛋白、Cbfa1 等 mRNA 表达水平均较对照组明 显升高，差异有统计学意义（P0.05）。 结论 瓣膜间质细胞可体外成功诱导钙化，钙化间质细胞呈现相对激活状态，表型向 收缩表型和成骨表型转化，可能为瓣膜钙化的细胞学基础。 关键词 主动脉瓣 钙化 间质细胞 表型 第三部分 瓣膜内皮细胞体外调控间质细胞钙化的实验研究 目的 构建瓣膜间质细胞和内皮细胞体外 3D 共培养钙化模型，观察瓣膜内皮细胞在 间质细胞钙化过程中的调控作用。 方法 取 4-8 代间质细胞单独或与内皮细胞共种植于 I 型胶原凝胶支架内，以含有 β- 甘油磷酸、维生素 C、地塞米松的钙化培养基进行钙化诱导培养 2 周。测量凝胶向心 性收缩评估瓣膜间质细胞收缩功能。茜素红染色观察并半定量检测钙沉积，Live/Dead 试剂盒检测钙化细胞存活率，检测碱性磷酸酶活性，免疫荧光染色检测间质细胞表型 激活（α-SMA）， Real Time RT-PCR 检测间质细胞 α-SMA 及钙化相关因子（骨钙素, 骨桥蛋白， Cbfa1）mRNA 表达水平变化。 结果 成功构建间质细胞和内皮细胞 3D 共培养钙化模型。钙化诱导组间质细胞收缩 能力强于对照组。茜素红钙沉积染色提示钙化诱导组基质内弥漫性钙化沉积，钙沉积 明显高于对照组; 凋亡检测和间质细胞表型检测提示钙化间质细胞呈现激活状态，伴 随明显细胞凋亡发生以及 α-SMA 表达上调，碱性磷酸酶活性上升，并高表达骨钙素、 Cbfa1 等钙化相关蛋白及转录因子；内皮细胞共培养可显著降低间质细胞钙沉积，减 弱钙化间质细胞收缩能力，并下调 α-SMA 表达，降低碱性磷酸酶活性，抑制骨钙素、 Cbfa1 等表达，保持骨桥蛋白相对高表达，使激活的间质细胞呈静息状态，缓解钙化。 结论 体外共培养瓣膜内皮细胞可缓解瓣膜间质细胞钙化的发生，其机制可