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提取枸杞棉蚜基因组DNA9种方法比较 　　摘要：为探讨适合枸杞棉蚜基因组DNA提取的方法，采用9种方法提取枸杞棉蚜基因组DNA，并对每种方法提取的DNA样本质量进行综合比较分析。结果表明，改进十二烷基硫酸钠（SDS）法、优化KAc法、STE精提法、Chelex粗提法、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、盐析法均可从枸杞棉蚜中提取总DNA，浓度高且所制备出的DNA均可成功应用于mtDNA CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因扩增。STE粗提法、Chelex精提法、饱和NaCl法Ⅱ提取的枸杞棉蚜基因组DNA质量低，不能满足分析要求。改进SDS法及STE精提法所制备的DNA质量较佳、产量较高、实用性强，是值得推广应用的枸杞棉蚜基因组DNA提取方法。盐析法提取DNA，试剂成本低、毒性小，是一种安全有效的枸杞棉蚜基因组DNA提取方法。Chelex粗提法是一种快速的枸杞棉蚜基因组DNA提取方法。 　　关键词：枸杞；棉蚜；基因组DNA；提取方法 　　中图分类号： S435.671文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）10-0030-04 　　枸杞棉蚜（Aphis gossypii Glover）属同翅目（Hompotera）蚜科（Aphididae）蚜属（Aphis），是我国西北地区栽培枸杞（Licium barbarum L.）分布地的主要害虫，短期内可暴发成灾，引起枸杞果产量和品质严重下降[1]。棉蚜具有明显的生物型[2-3]，如棉花型和黄瓜型[4-5]，而枸杞棉蚜属于何种生物型亟待验证。确定昆虫的生物型，不仅需要采用传统的生物学特征和生态学参数比较[4，6-7]，而且需要分子遗传学数据佐证[2，7-8]。 　　单头枸杞棉蚜基因组DNA提取是开展枸杞棉蚜分子遗传学研究的前提与基础[9]。由于枸杞棉蚜体型微小，体表有外骨骼，其DNA提取有一定难度。Black等通过十二烷基硫酸钠（SDS）方法提取蚜虫基因组DNA，并通过随机扩增多态性DNA-PCR（RAPD-PCR）检测蚜虫多态性[10]；龚鹏等在棉蚜DNA的提取中采用STE精提法，用简单重复序列PCR（SSR-PCR）技术研究了棉花和木槿上棉蚜的多态性[11]；安瑞生等对KAc法、SDS法的研磨步骤进行了改进[12-13]；张帆对改进后的KAc法中加入蛋白酶K进行了优化，并用 mtDNA-CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]技术研究了棉花型、黄瓜型棉蚜的多态性[14]。目前，国内最常用的2种棉蚜基因组DNA提取方法为改进SDS法和优化KAc法。国外棉蚜基因组DNA提取常采用SDS法[2，8]，以及Chelex粗提法[7，15]。 　　?樯秆〕鍪屎翔坭缴厦扪粱?因组DNA的提取方法，本研究借鉴国内外应用较多的提取蚜虫DNA的8种方法对其稍作改进，即改进SDS法、优化KAc法、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、盐析法、饱和NaCl法Ⅱ、STE粗提法、Chelex粗提法、STE精提法，并参照Chelex粗提法自创了Chelex精提法，对这9种方法提取的基因组DNA的质量、DNA提取所需时间、操作难易程度和所用试剂的毒性大小进行综合比较，为进一步开展枸杞棉蚜遗传结构分析奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　于2015年7―8月在青海诺木洪枸杞主产区蚜虫发生较重的栽培枸杞田，采集无翅蚜虫成虫，每株枸杞采集1头试虫，每头试虫所在植株至少间隔5 m，样品单头分别放于盛有无水乙醇的1.5 mL离心管中浸泡，于4 ℃低温采样箱内保存，带回实验室后，于-40 ℃超低温冰箱保存备用。试验时随机抽取。 　　1.2基因组DNA的提取方法 　　改进SDS法：参照杨子祥等的改进SDS法[16]，稍作改进。具体方法：将单头蚜虫在双蒸水中漂洗，滤纸吸干后转入1.5 mL离心管中，加入100 μL匀浆液（按A液 ∶[KG-*3]B液 ∶[KG-*3]C液体积比25 ∶[KG-*3]3 ∶[KG-*3]2配制。其中A液：Tris-HCl 10 mol/L，NaCl 01 mol/L，EDTA 1 mol/L，pH值为8.0；B液：10% SDS；C液：蛋白酶K 10 mg/mL）。用灭菌玻璃研磨棒对蚜虫进行研磨。并用500 μL匀浆液冲洗研磨棒，56 ℃水浴4 h（若裂解液未透明，水浴时间延长至8 h），其间摇匀3～4次。加入600 μL Tris饱和酚，在摇床上缓慢摇匀20 min后，7 000 r/min 离心10 min，取上清液。加入600 μL三氯甲烷 ∶[KG-*3]异戊醇（体积比为24 ∶[KG-*3]1），在摇床上缓慢摇匀20 min后，7 000 r/min 离心 10 min，取上清液。加入600 μL无水乙醇（-20 ℃预处理），混匀，-2