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拟南芥PHOT2基因超表达载体构建及转化 　　摘要：采用PCR技术扩增拟南芥PHOT2基因编码序列，并将其转入pSUPER1300超表达载体中，构建了 pSUPER1300-PHOT2 超表达载体，利用农杆菌介导花序转化法，转入拟南芥野生型gl1、phot1突变体中。PCR扩增及 RT-PCR 分析表明，该基因超表达，筛选到了潜在的转基因株系。 　　关键词：蓝光受体；向光素；超表达 　　中图分类号： Q943.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0030-02 　　收稿日期：2013-06-08 　　作者简介：乔新荣（1972―），女，河南新密人，博士，讲师，主要从事植物生理及分子生物学研究。E-mail：xinrong806@163.com。光向素（phototropin，PHOT）是植物特有的蓝光受体，PHOT1、PHOT2属于同一家族，其N端含有2个高度保守的光感受区LOV1（light，oxygen，voltage1）区、LOV2区，每个LOV区都结合一分子的黄素单核苷酸（FMN）作为发色团。C端是Ser/Thr蛋白激酶区，蓝光激活多个丝氨酸残基发生自磷酸化作用[1]。研究发现，PHOT1的第851位丝氨酸残基（Ser851）的磷酸化作用是PHOT1发挥其生理作用所必需的[2]。PHOT都定位于质膜，但蓝光会诱导部分PHOT1向胞质迁移，部分PHOT2移至高尔基体及叶绿体外膜[3-5]。PHOT1、PHOT2调节植物的许多生理反应，包括植物的向光反应、气孔开放、叶绿体迁移及提高弱光下植物的光合作用、降低强光对植物伤害等[1，6]。目前，学者们对PHOT1、PHOT2的结构及其生理作用有了较为深入的研究[7-8]，PHOT1、PHOT2以光强依赖方式共同介导植物的许多生理反应，如共同介导弱光下叶绿体的聚集运动及强光下下胚轴的向光弯曲[7]。为了进一步研究PHOT2基因的功能及该基因下游的信号调控网络，本研究通过基因重组技术，构建pSUPER1300-PHOT2超表达载体，转入野生型gl1及phot1突变体2种遗传背景材料，获得PHOT2超表达转基因植株，旨在为深入研究PHOT1、PHOT2所调控的信号网络提供遗传材料。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1植物材料拟南芥野生型gl1（Col-0生态型）、phot1突变体。 　　1.1.2试剂、菌株、载体大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株GV3101、超表达载体pSUPER1300、TaqDNA聚合酶为笔者所在实验室保存；克隆载体pMD18-T 、限制性内切酶、Oligo（dT）引物、核酸分子量标准（marker）、DNA凝胶纯化回收试剂盒及质粒提取试剂盒均购自TaKaRa公司；Trizol试剂购自 Invitrogen 公司；高效连接试剂盒Soultion I、M-MLV反转录酶、潮霉素B（hygromycin B）购自Promega公司；KOD-plus DNA 聚合酶购自ToYoBo公司；各类抗生素购自Solarbio公司；dNTP、普通PCR buffer购自天根生化科技有限公司。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司（以下简称上海生工）合成（表1）。 　　1.2方法 　　1.2.1总RNA提取及cDNA合成将野生型gl1种子点播于0.6% MS固体培养基上，取生长2周左右的无菌苗0.1 g，液氮研磨，按照Trizol试剂说明书提取总RNA 。将提取的总RNA在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。以合格的总RNA 为模板，参照M-MLV反转录酶说明书进行反转录，合成cDNA 第一链，立即使用或-20 ℃保存备用。 　　1.2.2AtPHOT2超表达载体构建根据TAIR网站上提供的AtPHOT1的CDS序列及pSUPER1300载体上的多克隆位点，选择XbaⅠ、KpnⅠ限制性内切酶，设计克隆引物PF1、PR1。以cDNA为模板，利用普通TaqDNA聚合酶预扩增预期片段，再用高保真酶KOD-PlusDNA聚合酶扩增回收。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，56 ℃复性40 s，68 ℃ 延伸3 min，30个循环；68 ℃延伸10 min。依据TA克隆试剂盒说明书将上述PCR 产物克隆到pMD18-T Vector，然后通过热激法将连接产物传入大肠杆菌DH5α中，并在含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的LB培养基上选择培养。菌落PCR、质粒PCR后，得到重组克隆pMD18-PHOT2质粒，送上海生工测序。以测序正确的pMD18-PHOT2质粒为模板，按上述引物、PCR程序再进行PHOT2片段扩增，回收片段、pSUPER1300 空质粒分别利用XbaⅠ、KpnⅠ酶切，连接并转化，进行PCR检测