出口食品中非可培养状态细菌的检验 征求意见稿.docVIP

SN/T ××××—×××× ICS FORMTEXT SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T FORMTEXT XXXXX— FORMTEXT XXXX 出口食品中非可培养状态细菌的检验 Detection of the Viable but Non-culturable Bacterial in foods for import 征求意见稿 FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX发布 FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局。 本标准主要起草人： 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 出口食品中非可培养状态细菌的检验 1 范围 本标准规定了出口食品中非可培养状态沙门氏菌、大肠杆菌的检验，包括荧光显微镜观察与计数方法、RT-PCR方法。 本标准适用于食品中非可培养状态沙门氏菌、大肠杆菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 3.1 VBNC 活的但非可培养 3.2 mRNA 信使核糖核酸 3.3 RNA 核糖核酸 3.4 Taq 酶 Taq DNA聚合酶 3.5 DEPC 焦碳酸乙二酯 4 设备和材料 4.1 倒置荧光显微镜：10×～100×。 4.2 恒温培养箱：36 ℃± 4.3 研磨仪。 4.4 吸管：1 mL、5 mL、10 mL，分刻度0.1 mL。 4.5 试管：16 mm×160 mm。 4.6 培养皿：直径90 mm。 4.7 接种环：3 mm。 4.8 天平：量程2 kg，感量0.1 4.9 样本稀释瓶：250 mL和500 mL。 4.10 灭菌样品处理器具：取样勺、剪刀、镊子。 4.11 无自发光的0.22 um微孔滤膜。 4.12 英雄牌黑色钢笔墨水。 4.13 无自发光香柏油。 4.14 LB液体培养基A.1。 4.15 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂A.2。 4.16 伊红美蓝琼脂（EMB）A.3。 4.17 LIVE/DEAD BaclightTM Bacterial Viability(13152)试剂盒1） 1）LIVE/DEAD BaclightTM是由Invitrogen公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 5 荧光显微镜观察与计数方法 5.1 方法提要 食品中非可培养细菌荧光显微镜观察与计数方法应用微生物检验对食品中可能存在的非可培养细菌进行定量的检验。 5.2 检验程序 5.2.1 样品前处理 取样品25 g（mL）加入到225 mL液体LB培养基中，利用研磨器磨制成悬浊液或将样品充分混合，悬浊液经过滤纸过滤后备用，液体样品混匀后备用。 5.2.2 样品镜检（按下列方法或试剂盒说明书进行操作） 5.2.2.1 将样品液7000 r/min，室温离心5 min，弃去上清。 5.2.2.2 加入50 uL的无菌蒸馏水进行沉淀悬浮，并加入配置好的工作浓度下细菌染色液50 uL，反复吹吸混匀，避光条件下染色15-20 min。 5.2.2.3 取灭菌细胞培养皿，将孔径为0.22 um的无自发光的微孔滤膜置于培养皿中央，滴加400 uL的黑色墨水于滤膜上，将滤膜染透。 5.2.2.4 取5.2.2.2混合液10 uL于滤膜中央，待混合液微干后盖上盖玻片，压紧。（注意：不可在菌液湿润和过于干燥时盖上盖玻片，都会影响观察效果。） 5.2.2.5 在盖玻片上滴一滴无自发光的香柏油，于暗室中观察并计数（激发光滤光片为480nm，荧光滤光片为510nm）。 5.2.2.6 荧光显微镜视野下VBNC状态细菌可呈现绿色荧光、菌体发生交联、直杆菌弯曲、杆菌断裂或变短、菌体聚集等状态。 5.2.2.7 荧光显微镜技术方法：至少随机选取10个视野并计数，每个视野中细菌数一般以30-50个为宜；公式如下： 该公式中：E为样品中细菌的总数（个/ml）；X为各计数视野中细菌总数的平均数（个）；S1为滤膜的面积（mm）；S2为油镜的视野面积（mm）；V为过滤样品的体积（ml）。 5.2.3 VBNC细菌的鉴定