有关兔视网膜色素上皮细胞体外培养技术及中药含药血清制备方法探讨.docVIP

有关兔视网膜色素上皮细胞体外培养技术及中药含药血清制备方法探讨 　　【摘要】细胞生物学是一切生命科学的重要基础学科。近年来，细胞生物学发展迅速，其研究成果被广泛地应用于生命科学的各个领域，成为现代生命科学的核心学科之一，本文就与细胞生物学密切相关的细胞培养技术（兔视网膜色素上皮细胞体外培养）及血清药理学技术（中药含药血清制备）在关键步骤上做了较细致的探讨。 　　【关键词】兔视网膜色素上皮细胞；体外培养；中药含药血清；制备 　　doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.11.685文章编号：1004-7484（2013）-11-6861-021体外培养兔视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞 　　组织培养工作始于1907年，美国动物学家Ross Granville Harrison为解决“神经纤维的起源问题”，而设计出的“一种能在生活状态下直接观察正在生长的神经末端的方法”，即哈里斯悬滴培养法，后经美国医生M.T.Burrows和Alexis Carrel不断的改进和完善，组织培养技术得以迅速发展，作为一种研究组织和活细胞的良好方法，由于其具有的诸多优越性，现已被广泛应用于生物学、医学与药学的各个领域，成为重要的基础科学之一。 　　视网膜色素上皮位于视网膜的最外层[1]，是由单层六角形的色素上皮细胞所构成，它具有多种复杂的生化功能以及支持光感受器活动的色素屏障功能，并具有对视网膜外层传递来自脉络膜的营养，和对光感受器外节脱落的膜盘及代谢产物进行吞噬的功能，其代谢异常和丧失，可引起视网膜感觉层发生继发性变性改变，甚至导致失明。在组织胚胎学上视网膜色素上皮层由神经外胚叶发育而来，胚胎4周时细胞内出现色素颗粒，至第5周则完全充满其中。体外培养的色素上皮细胞属于贴附生长型细胞，其形态为扁平的多角形，细胞质近中央处有圆形的细胞核，细胞之间紧密相靠、互相衔接，具有连接成片的能力。 　　1.1取材为了避免细胞的生长，在摘取兔眼时不能通过碘酒消毒，因为碘酒中的碘有抑制细胞生长的作用。另外还要注意将眼球摘除之后要将其放入冰箱当中，放置的时间要在15分钟，并且在放置之前还要进行庆大霉素生理盐水的浸泡，这样在色素上皮分离、视网膜神经分离就比较容易。为了减少碘进入兔眼视网膜的概率，此时应该着重关注眼球内层的色素上皮细胞。这一点很关键。如果发现摘取的细胞生长缓慢，那么在排除了生物因素、物理因素之后就要考虑到这方面的原因。 　　1.2分离进行上述操作后，我们就要将其分离，此时将眼球球角巩膜缘后的3毫米地方做一环形切口，将其去除晶体、角膜、玻璃体去除，力量一定要均匀，将眼科周围的（弯）的头部钝缘通过视网膜向视乳头进行轻刮，此时通过镊子将视网膜上的神经上皮去掉，这种方法是我们通过多次的实验总结出来的，通过这个可以干净、彻底地将视网膜进行分离。 　　1.3消化将去除视网膜神经上皮层的眼球挂置于自制的眼杯中（由橡胶瓶塞和针灸针制成），滴加0.25%的胰蛋白酶没至距角巩膜缘切口1mm处，放入二氧化碳孵箱中消化10-15min，消化时间可根据具体情况而定，如新制胰蛋白酶消化时间可相应缩短。与先消化后分离相比，我们的方法可以较准确地把握消化时间，同时消化洗脱下来的色素上皮细胞也较多，杂细胞较少。 　　1.4吹打我们总结了一下，吹打30-40次后就可以充分的将细胞制成悬液；另外在进行冲洗时最好选用合成培养液如DMEM代替PBS缓冲液，目的是尽可能地模拟细胞生存的内环境，减少细胞离体后再培养时的贴壁时间。 　　1.5关于微生物污染组织细胞在培养时一般失败的最主要的原因就是微生物的污染，在体外培养的细胞没有免疫能力，缺乏机体屏障，当发生细菌、霉菌时缺少相应的防御能力最终细胞出现死亡，鉴于这个原因，实验的成功就必须做好防止污染的工作，进行操作时要做到无菌操作，并且确保各个环节都是无菌状态。 　　我们的体会就是严格按要求操作，决不能马虎、懒惰，更不能抱有侥幸心理。无菌培养室每天都要用0.2%的新洁而灭擦洗地面一次，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30min。实验前认真清洗（经清洁液处理过的器具先用自来水冲洗20遍，之后一次蒸馏水清洗5遍，最后再用3次蒸馏水清洗3遍）、消毒培养用品；实验时也要保持无菌操作，如打开或封闭瓶口等都应在酒精灯近火焰处烧灼；拿取培养用品都应在超净工作台内完成；现在进行细胞培养大多数是通过二氧化碳孵箱，因此需要再次强调一下孵箱中的消毒的问题，孵箱虽然为细胞的生长提供了良好的环境，例如提供了恒定的二氧化碳、在维持PH值稳定时也做的相当的到位，但是开放式的培养，就给细菌、真菌提供了良好的生长环境，因此做好孵箱