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条件培养基对氧―葡萄糖剥夺诱导皮层神经元死亡保护作用 　　【摘要】 目的 研究脐带间充质干细胞源条件培养基（CM）对氧-葡萄糖剥夺（OGD）诱导皮层神经元死亡的保护作用。方法 培养 10 d的皮层神经元更换培养基为 EBSS平衡盐溶液， 后置于37℃低氧（N2∶CO2∶O2=94%∶5%∶1%）培养箱内孵育， 4 h后恢复正常条件培养， 同时更换为条件培养基作用20 h， 　　用Hoechst33342 / PI 的染色方法检测其死亡情况。结果 原代培养的 UCMSCs 传至第三代时， 细胞形态为长梭形的纤维状， 折光性好;在培养的皮层神经元建立OGD模型， Control组细胞死亡率为（5.85%±0.41）%， OGD组细胞死亡率（35.6%±1.75）%， Control组与OGD组比较差异有统计学意义（Plt;0.01）， OGD模型建立成功;复氧0 h时给予脐带间充质干细胞源条件培养基， 作用24 h后， OGD+CM组细胞死亡率为（27.98±2.19）%， OGD+CM组与OGD组比较差异有统计学意?x（Plt;0.05）， CM可使皮层神经元的死亡率降低21.40%。结论 脐带间充质干细胞源条件培养基对氧-葡萄糖剥夺诱导皮层神经元具有保护作用。 　　【关键词】 氧-葡萄糖剥夺模型;间充质干细胞;条件培养基;皮层神经元 　　DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2018.12.120 　　缺血性脑卒中是因各种原因导致大脑供血不足， 从而引起脑组织坏死的总称， 具有发病率高、致死率高和致残率高的特点。氧-葡萄糖剥夺（Oxygen-Glucose Deprivation， OGD）模型是最常用的缺血性脑卒中的体外模型， 能够在体外很好的模拟脑卒中的病理状态。 　　脐带间充质干细胞（Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells， UCMSCs）来源于中胚层间充质的成体干细胞， 具有易于获取， 无伦理学争议， 增殖能力较强， 易于体内外扩增等特性， 成为临床干细胞移植的重点关注对象， 然而无论通过何种途径输入体内， 到达靶器官的细胞数量、状态及存活时间尚无足够的研究证实， 而间充质干细胞在培养过程中发现其可通过旁分泌途径分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、 成纤维细胞生长因子（Basic Fibroblast Growth Factor， bFGF）等大量生物活性物质[1， 2]， 近年亦有研究报道间充质干细胞（mesenchymal stem cell， MSCs）衍生的胞外囊泡可参与细胞间传递、细胞内信号传导以及在体内短距离或长距离运输以改变细胞或组织的代谢[3]， 因此， 尝试使用脐带间充质干细胞来源的条件培养基（Condition Medium， CM）进行研究， 观察其保护神经元的作用。 　　目前应用细胞模型研究条件培养基保护OGD中神经元死亡的相关研究较少， 本实验制备脐带间充质干细胞来源条件培养基， 其中含有脐带间充质干细胞分泌的大量细胞因子成份， 在体外细胞培养模型中研究其对神经元的保护作用， 从而为缺血性脑血管病的临床治疗提供新的思路和实验依据。现报告如下。 　　1 材料与方法 　　1. 1 脐带间充质干细胞的原代培养与条件培养基的获取 　　UCMSCs的原代分离培养：将无菌条件下获取的脐带组织用无菌磷酸缓冲液（PBS）冲洗多次， 至无血迹残留;仔细剔除脐带内血管与表面组织;将组织剪碎， 加入Ⅳ型胶原酶， 　　37℃消化17～20 h， 期间不时摇晃;再用40 ?m筛网过滤， 去除较大组织块;2000 r/min， 离心5 min， 弃去上清， 将沉淀用无菌PBS清洗2～3次;1000 r/min， 离心5 min， 接种。用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬离心管中的细胞， 镜下细胞计数， 使细胞密度达到1×106个/ml， CO2培养箱培养， 换液， 将脐带间充质干细胞不断传代、纯化， 得到UCMSCs。 　　UCMSC-CM的收集：纯化后的UCMSCs， 收集每次换液的培养基， 经1500 r/min离心去除细胞碎片后， 放置在-80℃冰箱保存。 　　1. 2 Elisa检测条件培养基中细胞因子 向96孔板加入100 μl 1×稀释液， 作为阴性对照。同时加入所测因子的标准品100 μl到96孔板， 然后将所测样品100 μl加到96孔板， 每个样品2个微孔， 室温下避光孵育2 h。孵育结束后向每个微孔加入200 μl酶标检测抗体， 室温下孵育2 h。然后用400 μl l×冲洗液洗涤， 最后加入200 μl显色底物（显色剂A和显色剂B各100