星形胶质细胞在大鼠选择性结扎镜像痛模型脊髓中激活和意义.docVIP

星形胶质细胞在大鼠选择性结扎镜像痛模型脊髓中激活和意义 　　【摘要】 目的：观察星形胶质细胞在大鼠选择性结扎镜像痛模型脊髓中的激活情况。方法：实验组选择性结扎（SNL）镜像痛模型大鼠20只，对照组SNL非镜像痛模型大鼠20只，取第4～5腰椎段脊髓做石蜡切片，免疫荧光组织化学标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：实验组非手术侧（镜像痛）脊髓背角GFAP免疫阳性细胞数量增多，平均荧光强度增高，与手术侧比较差异无统计学意义（P0.05）；但与对照组非手术侧比较差异有统计学意义（P0.05）。结论：在神经病理性疼痛镜像痛中，镜像侧脊髓背角星形胶质细胞活化并参与了镜像痛的形成和维持。 　　【关键词】 星形胶质细胞； 神经病理性疼痛； 镜像痛 　　镜像痛是指当躯体某一组织或部位发生损伤后，导致损伤侧和对侧相应部位均出现疼痛和痛敏的一种现象[1]。临床常见于慢性病理性疼痛等出现的镜像痛，治疗效果不佳[2-5]。星形胶质细胞在神经性病理痛中的重要作用已经得到广大学者认可，在神经性病理性疼痛中脊髓星形胶质细胞被激活，胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达增高[6]。那么星形胶质细胞是否也在神经病理性疼痛镜像痛（neuropathic mirror-image pain，NMP）中发挥重要作用？目前鲜见报道。本实验采用免疫荧光组织化学方法，观察NMP大鼠脊髓镜像侧L4～L5段脊髓背角GFAP的表达情况，为进一步探讨NMP的发生机制提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂和仪器 免疫组织化学SP检测试剂盒、兔抗人GFAP多克隆抗体、TRITC标记山羊抗兔IgG均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；BH-60荧光显微镜为日本Olympus公司产品；SD大鼠由漯河医学高等专科学校实验动物中心提供。 　　1.2 模型制作与实验分组 首先制作大鼠脊神经选择性结扎模型，方法如下：氯胺酮10 mg/kg和甲苯噻嗪100 mg/kg腹膜腔注射麻醉大鼠，取俯卧位，络合碘溶液消毒皮肤，背部脊椎L3～S2节段作正中切口，分离右侧脊柱旁肌肉，暴露脊椎后，咬骨钳咬断L4～L6椎骨横突，分离并暴露，并用5-0丝线在近脊柱中线处结扎L4～L6脊神经，并于结扎远端进行离断，后逐层缝合切口[7]。 　　术后通过行为学观察、机械缩足反射阈值和热刺激缩足反射潜伏期等指标，筛选建立大鼠脊神经选择性结扎（SNL）镜像痛模型，补足20只为实验组[8]。从剩余的非镜像痛大鼠中随机选取20只为对照组。 　　1.3 取材与固定 各组大鼠用10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，4%多聚甲醛经左心室心脏灌注固定，取出脊髓L4～L5节段脊髓，标记组别、左（非手术）右（手术）侧，4%多聚甲醛浸泡固定8～12 h（4 ℃）。 　　1.4 免疫荧光标记GFAP的表达 脊髓组织经乙醇梯度脱水，石蜡包埋，4 μm石蜡切片，3%H2O2孵育37 ℃，20 min，血清孵育37 ℃，20 min后，标记一抗兔抗人GFAP，37 ℃孵育过夜；次日用dH2O、PBS各洗1次，5 min，后滴加羊抗兔TRITC；2 h后荧光显微镜观察，选择激发光波长为490 nm、滤色光波长为520 nm条件下拍照。每张图片以正中矢状线为界，每侧随机划取5个区域，用Image J（NIH）软件计算平均荧光强度。 　　1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，组内比较采用配对资料t检验，组间比较采用独立样本t检验，以P0.05表示差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 GFAP在脊髓背角的表达 各组进行GFAP免疫荧光组织化学显色，显示GFAP免疫阳性细胞在脊髓背角灰质广泛存在。10×倍下观察实验组镜像侧与手术侧荧光强度差异不明显（图1A），但与对照组非手术侧相比较（图1C），脊髓背角荧光强度较强；40×倍下观察实验组镜像侧与对照组非手术侧相比较，GFAP阳性细胞数较多，体积较大，突起较长（图1B、1D）。 　　2.2 GFAP平均荧光强度比较 实验组镜像侧（非手术侧）GFAP平均荧光强度为（9.75±1.68），明显高于与对照组非手术侧（3.69±1.52），比较差异有统计学意义（P0.05）；对照组手术侧GFAP平均荧光强度为（9.97±1.69）。 　　3 讨论 　　镜像痛是在临床上较为普遍的一种疼痛类型，表现为对侧肢体相应部位出现与患侧肢体相似的疼痛现象，表现为局限性疼痛、持续性疼痛、灼烧性痛等。临床上一些复杂的区域疼痛综合症、截肢和中风后遗症等多会出现镜像痛，加重了患者经济负担，也给患者带来极大的痛苦[9]。 　　星形胶质细胞被认为在神经病理性疼痛的发生和维持中