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枣树内生真菌分离鉴定及其多样性分析 　　摘要:为了解枣树内生真菌的种类和分布情况,采用常规分离方法,从不同品种整个生育期健康枣树的树皮、枣股、枝条、花、叶、果实中分离获得内生真菌1511株,共鉴定出15个真菌属,其优势属为链格孢属、茎点霉属(Phoma)、毛壳菌属(Chaetomium)和黑孢霉属(Nigrospora)。结果表明,健康枣树组织中内生真菌分布普遍,种类丰富;不同生育期,不同部位内生真菌的种类和数量都有所差异。 　　关键词:枣;内生真菌;分离 　　中图分类号:S665.1　文献标识码:A　文章编号:1009-9980(2010)06-975-05 　　 　　内生真菌是一种未被充分研究和利用的真菌资源,几乎所有植物都存在内生真菌,具有极大的科学研究价值和开发利用潜力。 　　植物内生真菌为植物组织内的正常菌群,与寄主植物间有非常复杂的关系。研究表明,内生真菌不仅能促进寄主植物的快速生长,增强植物的抗逆性,而且能产生丰富的与寄主植物相同或相似的,并具有生物活性的次级代谢产物,因此为抗生素和生物源药的研究开辟了一个新的方向。 　　关于内生菌(endophyte)的概念范畴一直有很大的争议。1991年,Petrin在Camll和Clay提出的概念范畴基础上进一步扩展,将内生菌定义为:内生菌包括那些在其生活史中的某一段时期生活在植物组织内。对植物组织没有引起明显病害症状的菌,该定义还包括了那些在其生活史中的某一阶段营表面生活的腐生菌,对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根菌。 　　枣是我国特有的果树树种,其栽培面积和产量占世界95%以上。鲜枣味美可口、营养丰富,具有极高的营养价值和药用价值。近年来随着农业产业结构的调整,枣种植业成为农业发展重点之一,红枣出口量也日益增加。 　　目前国内外尚未见有关枣树内生真菌及其与生理活性物质关系的研究报道。我们从不同枣树品种的树皮、枣股、茎、叶、花、果实等器官组织中分离到内生真菌,进行了初步鉴定,对枣树不同生育期、不同品种、不同部位的内生真菌多样性进行了比较研究,旨在较为系统研究枣树内生真菌多样性的同时,为研究其内生真菌的起源及其与宿主之间的关系提供一些素材,同时为枣树内生真菌的生物活性研究、枣树病害的防治研究和应用提供参考。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　供试枣树材料采自河南省新郑孟庄枣园的4个品种(感病品种:六月鲜、灰枣,抗病品种:鸡心枣、九月青)。 　　选材采用5点取样法。连续2 a选择生长性状良好、无病虫害症状的健康植株。 　　选取枣树整个生育时期(越冬期、发芽期、开花期、幼果期、果实膨大期、果实成熟期)健康枣树的树皮、枣股、枝条、芽、花、果实。 　　1.2　培养基 　　PDA固体培养基(其中营养成分为50%)和水琼脂培养基。 　　1.3　内生菌的分离与纯化 　　取采集的宿主植株茎、叶及果的健康组织,自来水冲洗干净晾干后用70%的酒精表面消毒2 min,然后用0.1%升汞浸泡3 min,再用无菌水冲洗3～4次。无菌条件下将经处理的各组织用消过毒的剪刀剪成3 mm见方小块放于固体培养基上,每皿放8块,并以组织印迹法(将消毒好待处理的材料在未使用的培养基平板上轻轻滚动或紧贴培养基放置5min后移走)设置对照处理,以检测表面消毒是否彻底。在25℃恒温培养箱培养。待各组织的切面处长出菌丝后,挑取菌丝尖端部分,转接于固体培养基上获得纯培养,并于PDA斜面中保存菌种。 　　1.4　内生菌的初步鉴定 　　根据菌落表面形态、大小、颜色、质地、生长速度、边缘形态,采用直接挑取制片法观测所得菌在培养过程中的菌丝、个体发育、产孢结构和孢子形态等特征,参考文献[6～9]鉴定到属。 　　对在人工培养条件下较少产孢的菌株采用菌落造伤、近紫外灯照射、TWA+WS培养基培养、冰箱短暂冷藏等方法诱导产孢。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2.1　枣树内生真菌的鉴定及多样性分析 　　从4个供试枣树品种整个生育期的树皮、枣股、茎、叶、花、果实中共分离到1511株内生真菌,经显微形态观察,鉴定菌株分别归属于15个属,归为7科5目3纲(表1)。少数菌株由于未产孢而未鉴定到属。由表1可以看出,所分离到的枣树内生真菌中除核菌纲(Pyrenomycetes)球壳菌目(Sphaeriales)的毛壳菌属(Chaetomium)和粪壳属(Sordaria)属于子囊菌门(Ascomycota)外,其余则属于半知菌(Mitosporic fungi)类的13个属。其中:丝孢纲(Hyphomycetes)包括镰孢座孢属(Fusarium)、链格孢属(Alternaria)、黑孢属(Nigrospora)等7个属;腔孢纲(Coelomycetes)6个属,