槲皮素对大鼠乳鼠心脏成纤维细胞炎症分泌干预作用.docVIP

槲皮素对大鼠乳鼠心脏成纤维细胞炎症分泌干预作用 　　[摘要] 该研究采用LPS 100 μg?L-1联合ATP 5 mmol?L-1建立大鼠乳鼠心脏成纤维细胞炎症分泌模型，考察槲皮素对心脏成纤维细胞炎症因子TNF-α，IL-6及IL-1β分泌的抑制作用，并进一步采用Western blot考察槲皮素对p-NF-κB p65（S276）及p-Akt（S473）蛋白表达的影响，探讨槲皮素抑制心脏成纤维细胞炎症分泌的作用机制。研究结果发现：①槲皮素51.74～827.81 μmol?L-1对大鼠心脏成纤维细胞活力无明显影响；②槲皮素82.78，41.39，20.70 μmol?L-1均可显著抑制LPS 100 μg?L-1作用3 h而后ATP 5 mmol?L-1作用36 h所致的TNF-α，IL-1β的水平升高（P-1均可显著抑制LPS 100 μg?L-1作用3 h而后ATP 5 mmol?L-1作用36 h所致的IL-6的水平升高（P-1未见明显影响；③槲皮素82.78，41.39，20.70 μmol?L-1均可显著抑制LPS 100 μg?L-1作用3 h而后ATP 5 mmol?L-1作用15 min所致的NF-κB p65（S276） 激活，以20.70 μmol?L-1最明显；槲皮素82.78，41.39，20.70 μmol?L-1均可显著抑制LPS 100 μg?L-1作用3 h而后ATP 5 mmol?L-1作用240 min所致的p-Akt（473）表达增加（P0.05）。因此，该研究认为槲皮素可通过抑制NF-κB p65（S276）和Akt（473）的激活而减少心脏成纤维细胞TNF-α，IL-6及IL-1β炎症因子的分泌。 　　[关键词] 槲皮素；心脏成纤维细胞；炎症因子；NF-κB p65；Akt 　　槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物，化学名为3，3′，4′，5，7-五羟基黄酮。槲皮素广泛分布于多种植物中，如槐米[1]、旋覆花[2]、金荞麦[3]等，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降糖降压及很好的心血管保护作用[4]。心脏成纤维细胞的免疫激活与炎症可能在心肌缺血再灌注损伤过程中扮演了重要角色[5]。本研究旨在探讨槲皮素对大鼠乳鼠心脏成纤维细胞炎症分泌的干预作用及其作用机制。 　　1 材料 　　1.1 动物 SD大鼠乳鼠，SPF级，出生2～3 d，雌、雄不限，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2012-0001。 　　1.2 药物与试剂 槲皮素购自中国食品药品检定研究院（批号100081-200907）。兔抗鼠波形蛋白相关抗原抗体（980788W，北京博奥森生物技术有限公司）；HRP-标记的羊抗兔IgG（C1711，北京普利莱基因技术有限公司）；大鼠TNF-α（RTA00），IL-6（R6000B）及IL-1β（RLB00）ELISA试剂盒均购自RD公司；LPS（L2880，Escherichia coli O55：B5），ATP disodium salt（A2383-1G）均购自Sigma公司；p-Akt（Ser473，4060）抗体及Akt（9272）抗体购自Cell Signaling公司；p-NF-κB p65（S276） 抗体（ab30623），NF-κB p65抗体（ab31481）及兔抗人Ⅷ因子相关抗原抗体均购自Abcam公司；彩色预染蛋白质相对分子质量标准（P0068），RIPA裂解缓冲液（P0013C），BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012） 均购自碧云天生物技术研究所。 　　1.3 仪器 垂直电泳仪（Bio-Rad，美国）；Chem Doc XRS+凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）。 　　2 方法 　　2.1 大鼠乳鼠心脏成纤维细胞的培养及鉴定 取2～3 d龄的SD大鼠乳鼠，无菌条件下取心脏，PBS清洗心脏，去掉心脏的心耳及大血管，用弯剪剪开心脏，75%乙醇浸泡30 s，以灭活心外膜和心内膜内皮细胞，PBS再洗心脏，将组织剪成约1 mm3大小的碎块，加入PBS配制的含0.062 5 g?L-1胰酶和0.05 g?L-1Ⅱ型胶原酶的混合消化液，37 ℃水浴旋转消化4～5次，每次12 min。消化上清液加入等体积的含10%新生牛血清的DMEM培养液终止消化。细胞悬液过200目筛，2 000 r?min-1离心10 min。离心结束后，弃上清，重新加入含10%新生牛血清的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至96孔（细胞活力检测）或者6孔（蛋白提取）或者预先放入盖玻片的24孔培养板（细胞鉴定）中，37 ℃，5% CO2培养箱差速贴壁1 h。1 h 后，弃未贴壁细胞，并用预冷的PBS洗贴壁细胞3遍，重新加入含10%新生牛血清的DMEM培