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植物和真菌多酚氧化酶分子生物学研究进展 　　摘要 多酚氧化酶（PPO）是细胞内酶促褐化反应的主要催化酶类，同时PPO催化的反应还可应用于多巴药物的生产、含酚污水的净化等方面。现在已经从多种植物和真菌中分离和克隆了PPO及其基因。阐述了多酚氧化酶的结构与功能特点，总结了目前已克隆的植物和真菌多酚氧化酶基因，分析其表达特性，并介绍了转基因方面的研究现状。 　　关键词 多酚氧化酶；酪氨酸酶；酶促褐化；基因克隆 　　中图分类号 Q946.5文献标识码A文章编号1007-5739（2008）18-0014-04 　　 　　多酚氧化酶（polyphenol oxidase，简称PPO）是一类普遍存在于植物、动物、真菌和细菌中的金属蛋白酶。PPO功能包括甲酚酶（Cresolase，EC.，将单酚氧化为二酚）、二酚氧化酶/儿茶酚氧化酶（catecholase，EC.，将二酚氧化为醌）。现在大部分文献将具有二酚氧化酶功能的酶统称为多酚氧化酶，不管是否具有单酚氧化酶的功能[1]。真菌中研究较多的是酪氨酸酶（tyrosinase）和漆酶（laccase）。 　　PPO在生物体酶促褐变、体内色素合成的过程中起关键的作用，尤其在果蔬酶促褐变过程中起重要作用。因此，对PPO及其基因的研究具有巨大的理论和应用价值。PPO在植物体细胞中定位于类囊体中，而其催化底物位于液泡，所以只有在亚细胞结构遭到破坏时，褐化反应才迅速发生。 　　近年来，对PPO的研究主要集中在其分布、特性、功能、酶活抑制等方面，对PPO基因的染色体定位、克隆、表达分析及基因转化的研究也屡见报道。目前已在甘蔗、马铃薯、西红柿、苹果、梨、葡萄、杨树、杏、茶树等植物中克隆了PPO基因。真菌中最早研究的是双孢蘑菇（Agaricus bisporus）PPO及其基因[2]，近年来在白腐菌Pycnoporus sanguineus、Pycnoporus cinnabarirus等菌种中分离了酪氨酸酶，克隆了酪氨酸酶基因，并对其外源表达做了系统研究[3]。 　　多酚氧化酶的开发应用是一个具有广阔市场前景的领域。该酶可以用于生产抗氧化物，作为食品添加剂或药物。生产L-多巴药物，催化蛋白―蛋白、蛋白―多糖的交联，用于污水治理。在食品工业中，啤酒、果汁等饮料在储存期间常会出现浑浊和沉淀，这与其中含有酚或芳胺类物质有关。如果用酪氨酸酶预先处理麦芽汁，使其中的酚氧化后除去，则可提高啤酒的质量和透明度。 　　本文对多酚氧化酶基因的克隆研究、表达分析以及基因转化等分子生物学方面的研究现状进行总结和阐述，并对PPO的结构、功能、激活和抑制等方面的研究作一综述。 　　 　　1PPO的结构与功能 　　 　　1.1PPO蛋白结构 　　植物PPO以非活化的形式存在于类囊体中，多肽链中含有一个8~12KD的信号肽，前体蛋白为50~70KD。酶蛋白由N-端信号肽、中间高度保守的Cu结合区和C-端疏水区3部分组成。PPO的Cu结合区是该酶的主要功能区，包括CuA和CuB 2个区域，CuA区含3个保守的组氨酸和1个半胱氨酸，CuB含3个或4个保守的组氨酸[4]，类似于软体动物的血蓝蛋白（hemocyanin）。其他部分则对酶的构象、高级结构的形成和维持起作用。关于植物PPO蛋白结构相关内容已有详细的综述[5]。 　　真菌酪氨酸酶没有信号肽，推测其位于细胞质中，或结合于细胞器上[1]。真菌酪氨酸酶一般产于胞质中，大部分以非活性的形式存在。在体内受蛋白酶激活，切除C-端的部分序列后，转变成活化状态，其成熟过程与胰凝乳蛋白酶的成熟很相似。Agaricus bisporus中提取的AbPPO1和AbPPO2活性蛋白分别为43KD和47KD，但其基因AbPPO1、AbPPO2编码的蛋白推测分子量则是64KD[2]。 　　1.2PPO的功能 　　PPO在生物体内除了催化酚类物质的氧化，导致褐化外，还参与其他生化合成途径。它可能作为一种金属氧化还原酶，参与光合作用，与氧结合并传递分子氧，以调节叶绿体中有害的光氧化反应速度；参与其中电子传递，起能量转换作用[6，7]。PPO还参与花色的形成，Nakayama等在金鱼草等的提取物中发现了一种新的酶――金鱼草素合成酶（aureusidin synthase），它以查耳酮（chalcone）为特异性底物，催化类黄酮（aurone）的形成，而后者是花中黄色形成的主要原因。通过对金鱼草素合成酶及其cDNA的研究发现，它与PPO有很高的相似性（39%～51%），属于PPO家族[5]。 　　另外，现有很多的研究发现，PPO表达能提高植物的抗病性[2]，该结论已通过转基因实验得到证实[8]，其抗病机理还有待进一步研究。在真菌中，酪氨酸酶与孢子的形成和稳定性有关，与防御和毒性机理有