桃蛀螟CpunPBP2基因全长序列克隆分子结构及系统发育分析.docVIP

桃蛀螟CpunPBP2基因全长序列克隆分子结构及系统发育分析 　　摘要：气味结合蛋白（odorant binding protein，简称OBP）能结合进入到触角内的脂溶性气味物质进行并运送到感受神经元受体部位，被认为是昆虫嗅觉的第1个生化步骤，其中性信息素结合蛋白（pheromone binding protein，简称PBP）属于OBP家族。利用cDNA末端快速扩增技术（rapid-amplification of cDNA ends，简称RACE）在已有报道桃蛀螟CpunPBP2片段的基础上，设计特异性扩增引物获得该基因的全长cDNA序列。序列分析表明，CpunPBP2基因具有昆虫OBP典型特征，即6个保守的半胱氨酸位点和信号肽序列。同源比对结果发现，CpunPBP2的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PBP2均具有较高的相似性。进一步进化分析结果表明，CpunPBP2能聚在鳞翅目昆虫PBP/GOBP超家族内。本研究结果为进一步分析桃蛀螟PBP2的生理功能奠定了分子基础。 　　关键词：桃蛀螟；基因；气味结合蛋白；性信息素结合蛋白；cDNA末端快速扩增技术；全长克隆；系统发育分析 　　中图分类号： S433.4 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）20-0050-04 　　昆虫作为历史上最长的动物类群之一，长期进化使它们形成了以触角为主的发达的嗅觉感受系统，借此识别环境中大量的化学信息作出准确判断，并产生一系列生理和行为反应，如寻找栖息、产卵场所等[1]。自1981年Vogt等用标记性信息素方法发现了第1个昆虫气味结合蛋白（OBP）――多音大蚕蛾雄蛾（Antheraea polyphemus）触角中的性信息素结合蛋白（pheromone binding protein，简称PBP）[2]以来，随着基因组和转录组测序技术快速发展及成本大幅度降低，已在不同昆虫中发现有超过400个OBP，它们分属于不同的目和科[3]。 　　根据保守半胱氨酸的数量以及氨基酸序列，昆虫OBP可分为4类：（1）经典OBP（classic OBP），特征为6个保守的半胱氨酸结构，鳞翅目昆虫的性信息素结合蛋白、普通气味结合蛋白（general odorant binding protein，简称GOBP）以及触角结合蛋白（antennal binding protein，简称ABP）均属于此类；（2）多C OBP（plus-C OBP），特征为超过6个以上的保守半胱氨酸结构，还常会在保守位置具有一个脯氨酸；（3）少C OBP（minus-C OBP），特征为少于6个半胱氨酸结构，仅在4个保守位置处有半胱氨酸；（4）典型OBP（atypical OBP），特征为拥有一段较长的C端序列[4-6]。在鳞翅目昆?x中，OBP的保守性较高，分类清晰，可以明显地分为3类：性信息素结合蛋白（PBP）、普通气味结合蛋白、触角特异性蛋白（antennal specific protein，简称ASP）或触角结合蛋白。鳞翅目雄蛾的触角高表达或专一表达PBP，且PBP可以结合由雌虫释放的性信息素[7-8]。但雌雄触角感器均有表达的PBP并不一定是对性信息素特异结合的，也能结合其他非性信息素物质[9-10]。 　　桃蛀螟[Conogethes punctiferalis（Guenée）]别称桃斑螟、桃蛀心虫、桃蛀野螟，隶属于鳞翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae）。桃蛀螟食性杂、分布广，其幼虫可危害板栗、桃、李、杏、玉米、蓖麻、向日葵等40多种果树、油料和粮食作物。近年来，陆续有报道发现，桃蛀螟在我国的长江流域、中部和北部地区对梨、板栗、向日葵、高粱、玉米的产量造成了重大危害[11-12]。桃蛀螟在幼虫期取食的部位以致于传统的化学农药很难对它们产生直接有效的作用。桃蛀螟性引诱剂的开发已成功应用于种群的预测预报，但直接用于害虫防治，同该技术应用于其他重要蛾类害虫的情况相似，无论是用交配干扰法还是大量诱捕法，都存在成本偏高、效果不理想等问题。况且现在使用的化学农药不仅仅会使害虫对杀虫剂产生抗药性，而且还会大大加剧环境污染和对非靶标生物的杀伤作用[13]。因此，生产上亟须更为高效的行为调控技术来防治这类害虫。桃蛀螟性信息素所含有的2种主要醛类组分（Z10-16：Ald、E10-16：Ald）在化学结构上也与其他螟蛾科害虫相同或相似。另外，桃蛀螟所危害的果树和农作物同样也是鳞翅目其他科害虫的取食对象，因此以桃蛀螟为研究材料的研究成果，也将对其他昆虫的相关研究具有很好的借鉴意义和应用价值。 　　1 材料与方法 　　1.1 供试昆虫 　　于2014年7―9月利用灯诱的方式，在淮北师范大学相山校区校园内采集试虫。随后将收取的成虫（约60头